Rekombinante Produktion und Charakterisierung der epidermalen Lipoxygenase AmbLOXe (Ambystoma mexicanum) und der homologen Lipoxygenase ALOXe3 (Homo sapiens)

Abstract

Erkenntnisse über molekulare Signale und zelluläre Ereignisse in hoch regenerativen Spezies, wie dem Axolotl, können Ansätze für regenerative Therapien zur Wundheilung und Gewebereparatur beim Menschen liefern. Die epidermale Lipoxygenase AmbLOXe, die während der Regeneration von Gliedmaßen beim Axolotl in hohem Maße produziert wird, scheint an solchen zellulären Ereignissen beteiligt zu sein. In vorausgehenden Studien konnte eine erhöhte Migration für AmbLOXe-transfizierte Zelllinien gezeigt werden. Für eine weiterführende Charakterisierung von AmbLOXe werden größere Mengen des Enzyms benötigt. Diese können nicht direkt aus dem Axolotl isoliert werden, sondern müssen über ein rekombinantes System produziert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte die epidermale Lipoxygenase AmbLOXe aus dem mexikanischen Axolotl (Ambystoma mexicanum), sowie ihr menschliches Homolog ALOXe3, rekombinant in Form von Inclusion Bodies (IBs) in Escherichia coli produziert und aufgereinigt werden. Eine Charakterisierung dieser IBs hinsichtlich ihrer genauen Enzymaktivität ist nicht möglich, da die von AmbLOXe katalysierten Reaktionen noch nicht aufgeklärt sind. Daher mussten alternative Ansätze zur Bestimmung der Enzymaktivität gefunden werden. Durch E. coli produzierte Inclusion Bodies wurden dabei erstmalig in Rahmen von Wundheilungsassays in der Zellkultur angewendet. Ein Wundheilungsassay mit Culture-Inserts ermöglichte es die Bioaktivität von AmbLOXe und ihrem Homolog ALOXe3 zu beurteilen. Die Applikation der IBs erfolgte dabei als Zellkulturbeschichtung und als Additiv im Medium. Bei beiden Applikationsformen von AmbLOXe wurden ≥ 90 % der Wundfläche geschlossen. Bei Kontrollen ohne IBs und mit nicht-funktionellen IBs aus GFP lag der Anteil der verschlossenen Wundfläche bei 50 bis 70 %. Für ALOXe3 waren ähnliche Effekte wie für AmbLOXe zu beobachten. Insgesamt konnte ein positiver Einfluss von AmbLOXe und ALOXe3 IBs auf die Wundheilung nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei den Lipoxygenase Inclusion Bodies um funktionelle Proteinaggregate handelt, die als Reservoir für aktives Enzym genutzt werden können.