Studien zur Assemblierung der Tat-Translokase von Escherichia coli

Abstract

Das twin-arginine-translocation (Tat)-System transportiert gefaltete Proteine über prokary-otische, plastidäre und einige mitochondriale Membranen. Das Tat-System von Escherichia coli besteht aus den Komponenten TatA/E, TatB und TatC. Diese assemblieren im Laufe des Transportes zu Tat-Komplexen mit unterschiedlichen Molekulargewichten, welche mit zu transportierenden Substraten interagieren können. TatB und TatC stellen zentrale Bestandteile aller bisher beobachteten Tat-Komplexe dar. Jedoch ist weder die Rolle von TatA/E bei der Assemblierung von Tat-Komplexen, noch die Stöchiometrie der einzelnen Komponenten in-nerhalb dieser Komplexe bekannt. Ebenso ist der Mechanismus des Tat-abhängigen Protein-transports ungeklärt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse der Tat-Komponenten und Tat-Substrate auf die bekannten Tat-Komplexe sowie auf einen bisher nicht charakterisierten Tat-Komplex untersucht. Hierfür wurden die assemblierten Tat-Komplexe in An- und Abwesenheit einzelner oder mehrerer Komponenten des Tat-Systems mittels BN-PAGE/Western-Blot analysiert. Für die Untersuchung des Einflusses von Tat-Substraten wurde die Substrataffinität der Tat-Komplexe anhand spezieller Aminosäureaustausche modifiziert. Hierbei zeigte sich, dass die Tat-Komponenten TatA/E, TatB und TatC essenziell für die Assemblierung funktionaler Tat-Komplexe sind. Außerdem handelt es sich bei dem zuvor nicht charakterisierten Tat-Komplex um einen TatABC-Komplex. Dieser liegt, in Anwesenheit von TatA, nicht in Assoziation mit Substraten vor. Die TatA-Abhängigkeit sowie die Dissoziation von assoziierten Substraten weisen darauf hin, dass es sich bei dem Tat-Komplex um ein spätes Intermediat des Tat-Translokons handeln könnte. Neben der Charakterisierung und Untersuchung von Tat-Komplexen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit ebenfalls Strategien für die Reinigung von Tat-Komplexen etabliert. Hierbei gelang es, die bisher bekannten TatABC-Komplexe anzureichern. Es konnten weiterhin Rückschlüsse auf die Stabilität verschiedener Tat-Komplexe gezogen werden. So zeigte sich, dass stabilisierende Agenzien wie Saccharose für die Anreicherung vom Tat-Komplex 2 benötigt werden, während Tat-Komplex 1 auch ohne den Zusatz von Saccharose angereichert werden konnte.