Die Herstellung von rekombinanten Proteinen in stabil exprimierenden eukaryo-tischen Zellen ist heute ein elementarer Bestandteil vieler biotechnologischer Prozesse. Es existieren zahlreiche Methoden, um Zellen mit einer stabilen und ho-hen Expression eines Proteins zu selektieren. Eine Bead-basierte Selektion ist leicht zu skalieren und verhindert unnötigen Selektionsstress. Allerdings existie-ren keine Bea-basierten Protokolle zur Selektion von hochproduzierenden Zellen. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine Methode entwickelt, die einfach zu skalieren ist, die Viabilität der selektierten Kultur nicht beeinträchtigt und es er-laubt, stabile hochproduzierende Zellen mittels magnetischer Beads zu selektieren.
Die sogenannte Strep-Tactin® assisted cell selection (STACS)-Methode basiert auf der Expression eines Membranproteins, welches mit einem Twin-Strep-tag® (TST) fusioniert ist und zusammen mit dem gewünschten Protein (POI) exprimiert wird. Ein weiterer Bestandteil ist eine feste Matrix, wie magnetische Beads, an die das Strep-Tactin® gekoppelt wird. Positive Zellen können bei einer Inkubation mit der Matrix mittels des präsentierten TST an das Strep-Tactin® und somit an die Matrix gebunden werden. Zellen, die dieses Konstrukt nicht exprimieren, werden durch Waschschritte entfernt. Anschließend werden die Zielzellen durch Zugabe von Biotin von der Matrix eluiert. Dabei eluieren Zellen mit einer hohen Expressi-on des POI und einer hohen TST-Konzentration auf der Oberfläche später. Kon-sekutive Selektionen führen am Ende zu hochproduzierenden stabilen Zellen.
CHO-Zellen, die ausschließlich mit STACS selektiert werden, weisen eine 3,2-fach höhere Volumenausbeute eines sekretierten rekombinanten Proteins auf als puromycinselektierte Kulturen. Durch eine der Antibiotikaselektion nachfolgende STACS-Selektion wird der Proteintiter ebenfalls um den Faktor 3,3 gesteigert. Damit wird in der vorgelegten Arbeit zum ersten Mal eine Bead-basierte Selektion für CHO- und HEK293-Zellen beschrieben, die während der Elution eine Fraktio-nierung der Zellen in Abhängigkeit der Konzentration eines Oberflächenmarkers erlaubt.
The production of recombinant proteins in stable high expressing cells is a fun-damental process in the biotechnology industry and academia. Several methods are available to select cells that exhibit a high and stable expression of a recombi-nant protein. Bead based methods can be scaled up easily avoiding selection in-duced cell stress. Indeed, no methods are described using bead-based selection that generate stable high producing cells based on the concentration of a surface marker. Therefore, a bead-based method has been developed to select stable high producing cells. The method can be scaled up easily and does not affect cell viabil-ity.
The method is based on the co-expression of the protein of interest and a membrane marker protein that is fused to a Twin-Strep-tag® (TST). Strep-Tactin® coated magnetic microbeads are immobilized on positive cells via the bond be-tween coated Strep-Tactin® and the TST fusion protein on the cells’ surface. Cells not exhibiting expression of the construct are removed by a consecutive wash procedure. Finally, cells are released from the beads by addition of biotin that binds to Strep-Tactin®. Low producing cells elute predominantly in early fractions due to the low concentration of TST surface marker. In contrast, high producing cells with a higher concentration of TST surface maker and more bonds to the microbeads elute in later fractions. Stable cells can be isolated by consecutive se-lections using the described method.
Using the new Strep-Tactin® assisted cell selection (STACS) method only, CHO cells are selected that exhibit a 3.2-fold higher volumetric POI expression com-pared to a stable puromycin selected culture. Additionally, it is possible to in-crease the titer of a puromycin selected culture by 3.3-fold by selecting the cells with STACS after the puromycin selection phase. Thus, this work is the first de-scription of a bead-based cell selection method that allows a fractionation of cells during the elution based on the concentration of a co-expressed surface marker.
