Biotechnologische Produktion von humanen Strukturproteinen

Abstract

Proteine, die aus der natürlichen extrazellulären Matrix gewonnen werden, wie Gelatine, kommen in der klinischen Forschung zum Einsatz. Gewöhnlich wird Gelatine aus tierischem Material gewonnen, wodurch das Risiko einer pathogenen Übertragung und einer uneinheitlichen Produktqualität von Charge zu Charge besteht. Eine rekombinante Produktion in Hefe umgeht diese Nachteile, indem die Herstellung mit reproduzierbarer Qualität in tierkomponentenfreien Medien gewährleistet wird. Ein gelatinemimetisches Protein (GelMP), das auf der Alphakette des menschlichen Kollagen I basiert, wurde in Komagataella phaffii unter der Kontrolle des Promotors der Methanol-induzierbaren Alkoholoxidase (AOX1) geklont. Ein produzierender Klon wurde ausgewählt und die Produktion auf einen 30-L-Maßstab hochskaliert. Das GelMP wurde in das Kultivierungsmedium sekretiert, und die Endausbeute betrug 3,4 g/L. Das Zielprotein wurde direkt aus dem zellfreien Medium durch eine Cross-Flow Filtration gewonnen. Neben dem Gelatine- mimetischen Protein wurde ein Fibrin-basiertes Protein rekombinant hergestellt. Die Fibrinogen-γ-Kette (FGG) ist eine von drei Proteinketten, die das Blutgerinnungsprotein Fibrinogen bilden. FGG zeichnet sich durch interessante biologische Funktionen aus, wie z.B. die Bindung von Integrinen, Leukozyten, Thrombozyten, Fibroblasten, Endothelzellen und dem Wachstumsfaktor FGF-2. In dieser Arbeit wurde rekombinantes FGG als Biomaterial auf Fibrinbasis in Escherichia coli hergestellt. Die Gensequenz der menschlichen Fibrinogen γ - Kette wurde Codon optimiert, synthetisiert und in E. coli eingebracht. Das FGG wurde im 10 L Kultivierungsmaßstab als Inclusion bodies produziert. Die IBs wurden solubilisiert und mittels Zwei-Schritt-Chromatographie auf eine Reinheit von > 90 % aufgereinigt. In Zellkulturexperimenten förderte sowohl das rekombinante FGG als auch das Gelatine-mimetische Protein die Adhäsion und Proliferation von aus Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (AD-MSCs). Der funktionelle Unterschied ist von nativem Fibrinogen und tierischer Gelatine nicht zu unterscheiden. Das GelMP und FGG sind Alternativen zur Herstellung und Gewinnung von humanbasierten Strukturproteinen für den Einsatz in der regenerativen Medizin.