Biotechnologische Produktion von humanen Strukturproteinen

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Gellermann, Pia: Biotechnologische Produktion von humanen Strukturproteinen. Hannover : Gottfried Wilhelm Leibniz Universität, Diss., 2020, VIII, 147 S. DOI:https://doi.org/10.15488/10828

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Proteine, die aus der natürlichen extrazellulären Matrix gewonnen werden, wie Gelatine,kommen in der klinischen Forschung zum Einsatz. Gewöhnlich wird Gelatine aus tierischemMaterial gewonnen, wodurch das Risiko einer pathogenen Übertragung und eineruneinheitlichen Produktqualität von Charge zu Charge besteht. Eine rekombinante Produktionin Hefe umgeht diese Nachteile, indem die Herstellung mit reproduzierbarer Qualitätin tierkomponentenfreien Medien gewährleistet wird. Ein gelatinemimetisches Protein(GelMP), das auf der Alphakette des menschlichen Kollagen I basiert, wurde inKomagataella phaffii unter der Kontrolle des Promotors der Methanol-induzierbaren Alkoholoxidase(AOX1) geklont. Ein produzierender Klon wurde ausgewählt und die Produktionauf einen 30-L-Maßstab hochskaliert. Das GelMP wurde in das Kultivierungsmediumsekretiert, und die Endausbeute betrug 3,4 g/L. Das Zielprotein wurde direktaus dem zellfreien Medium durch eine Cross-Flow Filtration gewonnen. Neben dem Gelatine-mimetischen Protein wurde ein Fibrin-basiertes Protein rekombinant hergestellt.Die Fibrinogen-γ-Kette (FGG) ist eine von drei Proteinketten, die das BlutgerinnungsproteinFibrinogen bilden. FGG zeichnet sich durch interessante biologische Funktionenaus, wie z.B. die Bindung von Integrinen, Leukozyten, Thrombozyten, Fibroblasten, Endothelzellenund dem Wachstumsfaktor FGF-2. In dieser Arbeit wurde rekombinantesFGG als Biomaterial auf Fibrinbasis in Escherichia coli hergestellt. Die Gensequenz dermenschlichen Fibrinogen γ - Kette wurde Codon optimiert, synthetisiert und in E. colieingebracht. Das FGG wurde im 10 L Kultivierungsmaßstab als Inclusion bodies produziert.Die IBs wurden solubilisiert und mittels Zwei-Schritt-Chromatographie auf eineReinheit von > 90 % aufgereinigt. In Zellkulturexperimenten förderte sowohl das rekombinanteFGG als auch das Gelatine-mimetische Protein die Adhäsion und Proliferationvon aus Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (AD-MSCs). Der funktionelleUnterschied ist von nativem Fibrinogen und tierischer Gelatine nicht zu unterscheiden.Das GelMP und FGG sind Alternativen zur Herstellung und Gewinnung vonhumanbasierten Strukturproteinen für den Einsatz in der regenerativen Medizin.
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Publikationstyp: DoctoralThesis
Publikationsstatus: publishedVersion
Erstveröffentlichung: 2021
Die Publikation erscheint in Sammlung(en):Naturwissenschaftliche Fakultät
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