Neue Ansätze zur Produktion von rekombinanten TGF-β3 in verschiedenen Expressionssystemen

Abstract

Der humane Wachstumsfaktor Transforming Growth Factor-β3 (TGF-β3) kommt im embryonalen und adulten Körper vor. Unter anderem beeinflusst das Zytokin in strukturgebendem Gewebe die Differenzierung von Zellen zu Chondrozyten. Diese Eigenschaft soll im Rahmen der DFG-Forschergruppe „Gradierte Implantate“ in einem medizinischen Produkt zusammen mit anderen Wachstumsfaktoren genutzt werden, um Verletzungen am Sehnen-Knochen-Übergang in der Schulterheilen zu können. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze zur Produktion von rekombinanten TGF-β3 evaluiert. Als Expressionsorganismen dienten das Bakterium Escherichia coli sowie die Säugetierzelllinien CHO-K1 und HEK293. Auf Grundlage der Aminosäuresequenz des humanen TGF-β3 wurden verschiedene Plasmide entwickelt und in die Organismen eingebracht. In E. coli wurde das Zielprotein als Monomer in Proteinaggregaten exprimiert. Mithilfe der statistischen Versuchsplanung wurde die Kultivierung im Schüttelkolbenmaßstab hinsichtlich einer möglichst hohen Proteinausbeute optimiert. Nach Solubilisierungsversuchen konnte die Löslichkeit schließlich mithilfe des Fusionsproteins Thioredoxin A erhöht werden. Im Anschluss erfolgte die Optimierung des Zellaufschlusspuffers und die Aufreinigung des Zielproteins über eine Nickel-Affinitätschromatographie. Für die Herstellung in CHO-K1-Zellenwurde zunächst eine geeignete Methode zur Polyethylenimin-vermittelten transienten Transfektion etabliert. Die Expression des Zielproteins TGF-β3 konnte im Anschluss nicht nachgewiesen werden. In den HEK293-Zellen wurde mittels transienter Transfektion die Expression von TGF-β3 erreicht. Das Zielprotein liegt neben der monomeren auch in seiner dimeren Form vor. Insgesamt konnten zwei vielversprechende Ansätze zur Produktion von rekombinanten TGF-β3 aufgezeigt werden.