Verfahrensentwicklung und Charakterisierung der biopharmazeutischen Produktion von niedermolekularer polySia avDP20

Abstract

Polysialinsäure (polySia) wird in seiner Funktion als humanidentisches und anionisches Biopolymer für verschiedenste pharmazeutische Anwendungen umfassend untersucht. Insbesondere die niedermolekulare Form der polySia mit einer charakteristischen Kettenlänge von 20 ± 6 Sialinsäure-Monomeren (polySia avDP20) zeigt vielversprechende Ansätze in der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen. Die vorliegende Dissertation beschreibt einerseits die Entwicklung und Validierung einer analytischen Methode zur Charakterisierung der tatsächlichen polySia-Kettenlänge sowie die Quantifizierung definierter Kettenlängenbereiche mittels HPLC-CAD. Unter Betrachtung der GMP-Richtlinien nach ICH Q2(R1) wurden die Methoden in Hinblick auf die Selektivität, Linearität, Arbeitsbereich sowie die Detektions- und Bestimmungsgrenzen validiert. Es konnte gezeigt werden, dass (Poly-) Sialinsäuren zwischen einen DP (degree of polymerization) von 1 (MW = 309 g mol-1) bis maximal DP65 in einem linearen Arbeitsbereich von 0,001 mg mL-1 - 10 mg mL-1 detektiert werden können. In der Quantifizierungs-anwendung konnte eine selektive Methode für langkettige (long chain, LC) polySia mit einem linearen Arbeitsbereich von 0,025 mg mL-1- 1 mg mL-1 und polySia avDP20 in einem Bereich von 0,02 mg mL 1 - 0,25 mg mL 1 entwickelt werden. Die entwickelte Analytik ist insbesondere in der zielgerichteten polySia avDP20-Produktion von hoher Relevanz. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit die Prozessentwicklung und -optimierung zur Produktion der humanidentischen polySia aus E. coli K1 sowie die Produktaufreinigung und Herstellung der biopharmazeutisch relevanten, niedermolekularen polySia avDP20 beschrieben. Die Kultivierungsbedingungen wurden zunächst durch eine Medienoptimierung in Schüttelkolbenversuchen verbessert. Nachfolgend wurde ein Prozess-Upscaling im Rührkesselreaktor in einem 1,5 L und 25 L -Maßstab durchgeführt. Bemessen an der Raum-Zeit-Ausbeute wurde die Produktivität um 227 % von 0,339 g L-1 auf 0,788 g L-1 polySia gesteigert. In einem pO2-kontrollierten Zulaufbetrieb zur Hochzelldichtkultivierung konnte eine Steigerung der Produktivität um 47 % von 1,3 g L-1 auf 3,7 g L-1 polySia erreicht werden. Nach der Produktaufreinigung lag polySia in hochreiner Form mit einer Kettenlänge > DP70 vor. Nachfolgend wurde das langkettige polySia-Material zur pharmazeutisch relevanten polySia avDP20 weiterverarbeitet. In der thermischen Hydrolyse wurden eine optimale Hydrolysedauer von ca. 55 min und eine Temperatur von 90 °C ermittelt. In der chromatographischen Trennung von polySia avDP20 wurde ein dreistufiger Gradienten entwickelt, mit Hilfe dessen insgesamt 4,5 mg (6,1 % Ausbeute) niedermolekulare polySia mit einer Kettenlängen von DP20 ± 9 isoliert wurden konnten.