Identifizierung neuer katalytischer und regulativer Komponenten des Purinnukleotidkatabolismus von Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer genetischen Sichtung

Abstract

Im Purinkatabolismus wurden gerade in den letzten Jahren viele Enzyme neu entdeckt und charakterisiert. Besonders die Forschungsarbeiten zur Uratoxidase zeigten die Wichtigkeit dieses Enzyms im Stoffwechsel der Pflanzen. Während bei Menschen und den meisten Primaten Harnsäure als Endprodukt ausgeschieden wird, baut die Uratoxidase in Pflanzen Harnsäure zu Allantoin ab. Eine arnsäureakkumulation ist toxisch für Pflanzen und führt zur Unfähigkeit einen Keimling zu etablieren. Die Mutationen von Genen deren Produkte Reaktionen katalysieren, welche der Uratoxidase im Stoffwechsel vorgeschaltet sind wie z.B. die xdh-Mutante, können diesen spezifischen Phänotyp unterdrücken, man spricht von einer genetischen Suppression. In einer genetischen Sichtung, bei der durch EMS-Mutagenese der uox-Samen Mutationen erzeugt wurden, konnten neben bekannten auch zwei unbekannte Suppressoren gefunden werden. Diese wurden als ups1-Mutanten mit jeweils einem Aminosäureaustausch bestätigt. Zur Familie der Ureidpermease (UPS) gehören in den Brassicaceae insgesamt fünf Transporter, von denen einer sehr wahrscheinlich ein Pseudogen ist und daher nicht weiter untersucht wurde. In der Einzelmutante uox akkumuliert Harnsäure in großen Mengen. Die Suppressoren S-A231V und S-E209K akkumulieren wie die ups1 x uox Doppelmutante nur halb so viel Harnsäure im Samen wie die übrigen ups x uox Doppelmutanten. Hintergrund ist der niedrigere Harnsäureimport in den Samen wie durch Kreuzungen bestätigt werden konnte. Die UPS-Transporter wurden in Spezies wie Reis, Soja- oder Gartenbohne als Allantointransporter charakterisiert. In A. thaliana konnten für UPS5 in vitro jedoch bessere Spezifitäten für Uracil als Allantoin nachgewiesen werden. Die Etablierung und Messung verschiedener heterozyklischer Verbindungen in der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie sollte zu einem besseren Verständnis der Transporter in vivo beitragen. Da der Funktionsverlust eines einzelnen Transporters sehr wahrscheinlich durch die verbliebenen funktionsfähigen Transporter ausgeglichen werden kann, wurden Mehrfachmutanten der Transporter mittels CRISPR/Cas9-System generiert. In der Dreifachmutante ups1 x ups2 x ups5 konnte in Blättern eine Akkumulation und in Samen eine Verringerung von Uracil festgestellt werden, die in den Einzelmutanten und auch in der Doppelmutante ups1 x ups5 nicht detektierbar war. Die UPS-Transporter vermitteln somit den Transport von Uracil von altem in neues Gewebe. Auch Dihydrouracil ist wahrscheinlich ein in vivo Substrat von UPS. Promotor-GUS-Studien der einzelnen Transporter zeigten, dass vor allem UPS1 und UPS5 in verschiedenen Geweben zu unterschiedlichen Zeitpunkten aktiv sind. Während der Embryonalentwicklung wurde eine Aktivität von UPS1 in den Kotyledonen und von UPS5 im Hypokotyl beobachtet.