Quantifizierung der Freisetzung und Aktivität des Signalfaktors BMP-2 zur Induktion der osteogenen Differenzierung

Abstract

Das Zystinknotenprotein Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) ist ein wichtiger Wachstumsfaktor in der Knochenbildung während der Embryonalentwicklung und spielt ebenso eine wichtige Rolle wäh¬rend der Knochenregeneration. In der Forschergruppe „Gradierte Implantate“ sollen neben BMP 2 zur Knochenregeneration auch der transformierende Wachstumsfaktor β zur Knorpelzelldifferenzierung und Smad 8 L+MH2, ein modifizierter Transkriptionsfaktor, zur Sehnenzellbildung eingesetzt werden. Alle drei Signalfaktoren werden mithilfe von Nanopartikeln, die diese zeitlich gradiert abgeben, auf eine elektrogesponnene Polycaprolacton-Fasermatte, welche das Basismaterial des Implantats dar¬stellt, aufgebracht. Das entwickelte Implantat soll zur Reparatur von defekten Sehnen-Knochen-Über¬gängen eingesetzt werden. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf BMP-2 als osteoinduktives, implantatgebundenes Protein, sowie dessen Freisetzung und Aktivität. Dazu werden im ersten Teil der Arbeit Untersuchungen zur osteogenen Differenzierung durchgeführt. Es wird gezeigt, dass das osteogene Potential von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) stark spenderabhängig ist. So weisen von den getesteten 17 Spendern nur fünf die Merkmale einer erfolgreichen osteogenen Differenzierung auf. Zusätzlich kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Kombination der Faktoren β Glycerophosphat, BMP-2 und Ascorbat-2-Phosphat am effektivsten die osteogene Differenzierung induziert. Um bei den Freisetzungsuntersuchungen nur das bioaktive BMP-2 zu quantifizieren, wird in dieser Arbeit der BMP-Responsive-Element-Luciferase-Test genutzt, der sensitiver und schneller durchführbar ist als vergleichbare Verfahren wie z. B. der Alkalische Phosphatase Test. Der BMP-Responsive-Element-Luciferase-Test wurde in der hier vorliegenden Promotionsarbeit unter anderem auf die Durchführung im 96-Loch-Plattenformat optimiert und ermöglicht so einen höheren und schnelleren Messdurchsatz der unterschiedlichen Proben. Für den Einsatz auf dem gradierten Implantat wird die Freisetzung und Aktivität von BMP-2 aus organischen und anorganischen Nanopartikeln untersucht. Dabei werden anorganische aminomodifizierte Partikel (SiNH2) und Aminohexylaminopropyl-modifizierte (SiAHAP) nanoporöse Silica-Nanopartikel sowie organische acetylierte Chitosan/Tripolyphosphat-Partikel (CS(58)/TPP und CS(83)/TPP) und Alginat/Poly-L-Lysin-Partikel untersucht. Da zunächst nachgewiesen werden kann, dass die eingesetzten Konzentrationen der Nanopartikel auf MSC nicht zytotoxisch wirken, wird untersucht, ob die mit BMP-2-beladenen Partikel in vitro Osteogenese induzieren. Hierbei zeigen insbesondere die anorganischen SiNH2 sowie die organischen Chitosan-Nanopartikel eine Induktion der osteogenen Differenzierung, die durch eine Hochregulation der untersuchten osteogenen Markergene Osteopontin, Integrin-binding Sialoprotein, Runt-related transcription factor 2 und Osteocalcin belegt wird.