Rekombinante Produktion der fibrinogen gamma chain (FGG)

Abstract

Die Fibrinogen-γ-Kette (FGG) ist eine von drei Proteinketten, welche am Aufbau des Blutgerinnungsproteins Fibrinogen beteiligt sind. FGG zeichnet sich durch wichtige biologische Funktionen, wie die Bindung von verschiedenen Zelltypen, Wachstums- und Koagulationsfaktoren aus. Ziel der Arbeit ist es FGG als neues innovatives Fibrin-basiertes Biomaterial rekombinant herzustellen, um es als Grundgerüst für Blutgefäßprothesen oder auch als Beschichtungsmaterial in der Zellkultur einzusetzen. Für die Herstellung eines Produktionsstammes wurde die Gensequenz der humanen Fibrinogen-γA-Kette codonoptimiert, synthetisiert und in den Stamm SMD1168 der methylotrophen Hefe Komagataella phaffii eingebracht. Nach Screening von über 200 Klonen konnte jedoch weder im Kulturüberstand noch im Zelllysat FGG nachgewiesen werden. Durch das Einbringen der für Escherichia coli optimierten Gensequenz konnte hingegen ein Produktionsstamm generiert werden, welcher FGG als unlösliches Protein in inclusion bodies bildete. Durch Koproduktion von Chaperonen, konnte in geringen Mengen lösliches Protein produziert werden. Da die Zellen aber zu gestresst waren und im Vergleich immer deutlich mehr unlösliches Protein gebildet wurde, erfolgte die Aufarbeitung des FGGs aus inclusion bodies. Durch einen milden Solubilisierungsprozess mit 3 M Urea konnte FGG in Lösung und durch ein On-colum Refolding in einen stabilen löslichen Zustand ohne Urea gebracht werden. Mittels Zelladhäsionsassays konnte gezeigt werden, dass das Protein bioaktiv war. In einem Design of experiments mit Box-Behnken-Design wurden optimale Produktionsbedingungen ermittelt. Durch Übertragung der Bedingungen in den 2L-Rührkesselreaktor konnten 251,48 mg/L rekombinantes FGG produziert werden.