Die Bekämpfung des Denguefiebers stellt eine globale Herausforderung dar, denn nahezu die Hälfte der Weltbevölkerung ist von einer Infektion bedroht und die Infektionsrate steigt kontinuierlich. Es handelt sich um eine virale Infektionskrankheit, die starke Schmerzen verursacht und tödlich verlaufen kann. Die Herausforderung bei der Entwicklung eines Vakzins gegen das Denguefieber wird maßgeblich durch die Koexistenz von vier Serotypen des Erregervirus verursacht, welche alle gleichzeitig abgedeckt werden müssen.
Das vorgestellte Projekt zur Entwicklung eines Vakzinkandidaten sieht die Kombination verschiedener Hüllproteine des Denguevirus in virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Ein Hüllprotein des Denguevirus Serotyp 1 wurde in Escherichia coli exprimiert und akkumulierte in Form von Inclusion Bodys (IBs). Nach dem Ultraschallaufschluss der Zellen wurden die IBs abzentrifugiert und mit Guanidin solubilisiert. Die chromatographische Feinreinigung erfolgte mit einer Ni2+-NTA-Säule, von der das Produkt mit einer Reinheit von 90-99 % eluierte.
Während der nachfolgenden Dialyse renaturierte das Protein und bildete selbstanordnend VLPs. Ihr Durchmesser folgte einer Verteilung, deren Mittelwert von den Renaturierungs-bedingungen abhängig war. In Carbonatpuffer bei pH 10 wurden sowohl mit dem Rasterkraft-mikroskop als auch mit dem Fluoreszenzmikroskop sphärische Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 50 nm beobachtet. Die VLPs ähnelten somit dem Denguevirus, welches ebenfalls 50 nm misst, sie induzierten jedoch kaum neutralisierende Antikörper und erzielten daher nicht die nötige immunologische Funktion.
Bei der Lagerung über einen Monat erwiesen sich VLPs in Carbonatpuffer als stabil, während solche in Ammoniakpuffer zeitabhängig aggregierten. L-Arginin wirkte in diesem Zusammen-hang aggregationsverzögernd. Bei Erhitzung aggregierten VLPs in Carbonatpuffer bei 50-55 °C und wiesen somit eine mit dem Denguevirus vergleichbare Stabilität auf.
Ein zweites Zielprotein mit geringfügig abweichender Sequenz konnte nicht mit demselben Verfahren hergestellt werden, vermutlich aufgrund molekularbiologischer Eigenschaften des Stammes.
Um die Teilnahme zweier Hüllproteine am selben VLP (Bivalenz) nachzuweisen, wurde ein fluoreszenzmikroskopisches Verfahren entwickelt, mit dem bisher jedoch keine bivalenten VLPs detektiert werden konnten. Die Herstellung weiterer viraler Hüllproteine und deren Kombination in VLPs sind Gegenstand aktueller Forschung. Mit dieser Arbeit wurde ein Beitrag zur Entwicklung eines Impfstoffkandidaten und somit zum globalen Kampf gegen das Denguefieber geleistet.
Dengue fever control is a global challenge as almost half of the world's population is at risk of a dengue infection and morbidity is increasing steadily. Dengue fever is a viral infectious disease that causes severe pain and can be lethal. The main challenge in dengue vaccine develop-ment is the coexistence of four dengue virus serotypes, which need to be covered all at the same time.
The presented project on the development of a vaccine candidate aims the combination of different dengue envelope proteins in virus-like particles (VLPs). An envelope protein of dengue virus serotype 1 was expressed in Escherichia coli and accumulated in inclusion bodies (IBs). After cell disruption by sonication IBs were pelleted by centrifugation and solubilized using guanidine. Chromatographical purification was performed with a Ni2+-NTA column resulting in a target protein purity of 90-99 %.
During subsequent dialysis the protein renatured and self-assembled VLPs, the average diameter of which was dependent on renaturation conditions. In carbonate buffer at pH 10 VLPs were observed to be spherical particles with an average diameter of 50 nm using both an atomic force microscope and a fluorescence microscope. Although their appearance and diameter equalled the original dengue virus, VLPs were not capable of eliciting neutralizing antibodies and did therefore not provide immunological funcionality.
VLPs were stable during storage in carbonate buffer for at least one month, whereas VLPs in ammonia buffer tended to aggregate gradually. L-Arginine was found to hinder aggregation effects during storage. A temperature increase led to aggregation of VLPs in carbonate buffer at 50-55 °C, hence VLP stability was comparable with natural virus stability.
A second target protein with few amino acid sequence changes could not be produced successfully with the same procedure. This observation is probably caused by molecular biological characteristics of the producing E. coli strain.
To verify the combination of two different envelope proteins in the same VLP (bivalency) a fluorescent microscopical analysis was developed. However, by now there was no bivalency detected with this method. The production of further viral envelope proteins and their combination into VLPs are currently under development. This work contributes to the development of a vaccine candidate and hence supports the global dengue fever control efforts.
