Adaption und Automatisierung eines In-vitro-Selektionsverfahrens

Abstract

Molekulare Erkennung wird in vielen Bereichen der Analytik und Biotechnologie genutzt. Meist werden dabei Antikörper eingesetzt. Aber auch artifizielle Affinitätsliganden wie Aptamere drängen immer stärker in den von Antikörpern dominierten Markt. Aptamere werden im Labor aus einer großen Startbibliothek aus unterschiedlichen, einzelsträngigen RNA- oder DNA-Sequenzen isoliert, dieser Selektionsprozess wird SELEX genannt (kurz für Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment).

In dieser Arbeit soll die Selektion von Aptameren untersucht werden. Dazu wurde eine "minimale" SELEX entworfen, die dabei den kompletten Kernprozess der Selektion abbildet. So läuft die minimale SELEX in Selektionsrunden aus Abtrennung der ungebundenen Aptamerkandidaten nach Inkubation mit dem Zielmolekül, Amplifikation der verbliebenen Aptamerkandidaten und Produktion neuer einzelsträngiger Aptamerkandidaten. Über mehrere Selektionsrunden werden dabei nieder-affine Aptamerkandidaten aufgrund des angelegten Selektionsdrucks aus der Selektion verdrängt. Um den Prozess beurteilen, kontrollieren sowie einen definierten Selektionsdruck einstellen zu können, wurde eine Analytik auf Basis der Real Time PCR entwickelt. Durch die engmaschige Prozessüberwachung und resultierende Steuerungsmöglichkeiten wird eine Verbesserung der Erfolgsaussichten der Selektion angestrebt. Anschließend wurde die Funktionalität dieser entwickelten minimalen SELEX und der Analytik in einer de novo Selektion gegen His-Tag-Proteine demonstriert.

Durch Einsatz dieser Prozessüberwachung konnte gezeigt werden, dass die minimale SELEX beim Einsatz gegen das Wilson-Protein (ATP7B) durch die Bildung von Nebenprodukten während der Amplifikation der Aptamerkandidaten behindert wird. Diese Nebenprodukte entstehen durch partielle Hybridisierung zwischen den Aptamerkandidaten. Durch die Integration der EmulsionsPCR in die SELEX konnte die Entstehung von Nebenprodukten jedoch effektiv unterdrückt werden.