DNA-Markierung von AD-hMSCs mittels Elektroporation und deren Einfluss auf Zellcharakteristika

Abstract

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) werden häufig autolog (Donor und Empfänger sind identisch) in der Stammzelltherapie und dem Tissue Engineering angewandt, da hierbei mögliche Abstoßungsreaktionen umgangen werden. Für den Erfolg solcher Therapien ist u.a. die Distribution der transplantierten Zellen entscheidend. Ebenso kam es nach der Stammzell-Transplantation in einigen Studien zur Tumorformation im Patienten. Daher ist eine Markierung vor einer autologen Transplantation notwendig, um sie anschließend zu identifizieren und ggf. den Ursprung von entartetem Gewebe zu klären. Markierte Stammzellen können aber auch in vitro angewandt werden, um sie z.B. auf lichtundurchlässigen Trägermaterialien nachzuverfolgen (z.B. in Migrationsstudien).In der vorliegenden Arbeit wurden hMSCs aus dem Fettgewebe (AD-hMSCs) mit DNA markiert. Zunächst wurde die Elektroporation als DNA-Transfermethode etabliert. Hier perforiert ein elektrischer Puls die Zellmembran, was einen DNA-Transfer aus der Umgebung in die Zielzellen erlaubt. Zudem wurden Transfektionseffizienzen und der Einfluss der Elektroporation mit egfp (verbessertes grün fluoreszierendes Protein, engl. enhanced green fluorescent protein)-Reporterplasmid bzw. fluoreszenzmarkierter Nonsens-DNA auf die Zellcharakteristika untersucht und mit der lentiviralen Transduktion als Standardmethode zur MSC-Markierung verglichen. Die Elektroporation führte zu hohen Transfektionseffizienzen (Nonsens-DNA: 44.5%, egfp-Plasmid: 29.5%). Im Falle der Nonsens-DNA blieben alle untersuchten Zellcharakteristika erhalten. Nach egfp-Plasmid-Elektroporation und nach lentiviraler Transduktion war die Differenzierungskapazität herabgesetzt und lentivirale Transduktion führte zu einem veränderten Immunophänotyp. Weiterhin wurden die elektroporierten AD-hMSCs in vitro nachverfolgt. Hierbei konnten EGFP-markierte AD-hMSCs optisch online nachverfolgt werden, während das Signal der Nonsens-DNA für eine online Beobachtung jedoch zu schwach war. Die Ergebnisse zeigen, dass die Elektroporation ohne die gleichen Sicherheitsrisiken (z.B. mögliche Mutagenese) eine gute Alternative zu viralen Methoden zur AD-hMSC-Markierung darstellt. Insbesondere Nonsens-DNA-markierte AD hMSCs können sowohl in vivo als auch in vitro angewandt werden, da sie keine typischen Zellcharakteristika verlieren. EGFP-markierte AD-hMSCs hingegen sind beschränkt auf Studien, die keine Differenzierung erfordern.