Biotransformationen von Farnesylpyrophosphat-Analoga durch Sesquiterpencyclasen

Abstract

Terpene bilden mit mehr als 80 000 bekannten Verbindungen die größte Klasse sekundärer Naturstoffe. Trotz ihrer strukturellen Vielfalt, lassen sie sich anhand ihres aus Isopreneinheiten bestehenden Grundgerüsts zu einer Naturstoffklasse zusammenfassen, dessen Ursprung in den gemeinsamen biosynthetischen Bausteinen Isopentenylpyrophosphat and Dimethylallylpyrophosphat begründet ist. Ihre Kondensation führt zu den linearen Vorläufern Geranyl-, Farnesyl- und Geranylgeranyl-pyrophosphat, welche mit Hilfe von Terpencyclasen zu Terpenen umgesetzt werden. Diese Enzyme haben die faszinierende Eigenschaft die schlichten, linearen Vorläufer der Terpene in nur einem Schritt stereoselektiv in vielfältige und komplexe, zum Teil mehrzyklische Produkte zu verwandeln. Indem die gewöhnlichen Substrate der Terpencyclasen durch synthetisch zugängliche Pyrophosphate ersetzt werden, kann ihr Potential genutzt werden, um neue, strukturvariierende Terpenoide zu erhalten, die anschließend für die semisynthetische Produktion von entsprechenden Wirk- und Duftstoffen eingesetzt werden können. Da die Biotransformation unnatürlicher Farnesylpyrophosphat-Derivate durch Sesquiterpencyclasen bisher kaum erforscht wurde, konzentriert sich diese Arbeit auf die Untersuchung der Substrat-spezifität dieser Enzyme sowie auf die Identifizierung der Produkte dieser Biotransformationen. Dafür wurden acht Sesquiterpencyclasen pflanzlichen, bakteriellen und fungalen Ursprungs, welche höchst diverse Zyklisierungsprodukte mit unterschiedlich starker Produktpromiskuität bilden, heterolog in E. coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Zudem wurden Schwefel-funktionalisierte Farnesylpyrophosphat-Derivate synthetisiert, welche neben weiteren Analoga, mit anderen Heteroatomfunktionalisierungen oder abweichenden Methylierungsmustern, als Substrate für die rekombinanten Sesquiterpencyclasen getestet und bewertet wurden. Dabei wurden die meisten Farnesylpyrophosphat-Derivate als Substrate akzeptiert und zahlreiche neue, bisher unbekannte Terpenoide erzeugt. Zur Identifizierung dieser Produkte erfolgte ein Upscaling dieser Biotransformationen mit Anpassung der Reaktionsbedingungen. Die präparativen Biotransformationen von drei ether- und thioetherfunktionalisierten Pyrophosphaten führten zur Bildung neuer 11-gliedriger Makrozyklen. Abschließend wurden mehrere Mutanten der Sesquiterpencyclasen erzeugt, welche Rückschlüsse hinsichtlich des Einflusses ausgewählter Aminosäuren auf das Produktspektrum und die Substrattoleranz zulassen könnten. Mit diesen Mutanten erfolgten bereits erste Biotransformationen von Farnesylpyrophosphat und eines etherfunktionalisierten Derivats, welche zum Teil veränderte Produktspektren aufwiesen.