Nanoporous silica nanoparticles and bone morphogenetic protein 2 for bone regeneration

Abstract

Injuries of the musculoskeletal system, which is made up of the bones of the skeleton, muscles, cartilage, tendons, ligaments, joints and the connective tissue, are among increasing health care issues of the ageing population worldwide. Classical treatments often fail to restore the functionality of the damaged tissue leading to chronical pain and physical disabilities. Thus, the limitations of the current therapies point to the clinical need for effective healing strategies providing a target for innovative tissue engineering approaches. Among these approaches, growth factor delivery from a scaffold is one of the promising approaches for tissue regeneration. In this work, sophisticated nanoplatforms for the controlled loading and delivery of the growth factor bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) were developed by using nanoporous silica nanoparticles (NPSNPs) for applications in the field of bone tissue engineering and regeneration. Spherical NPSNPs were synthesised by the sol-gel method with the aid of a structure-directing surfactant. Subsequently, NPSNPs were modified by post-synthetic reactions with different organosilane coupling reagents to obtain NPSNPs with versatile surface chemistries and by that, to control the loading capacities and release kinetics of BMP-2. Before loading of the BMP-2, it was shown that hydrolytically highly stable moieties were present on the surface of aminopropylsilyl-modified NPSNPs; these moieties caused pore clogging. However, this pore clogging could be removed by post-synthetic reactions, an important finding with regard to the construction of NPSNP-based drug delivery devices. After the loading of BMP-2 on the surface of differently modified NPSNPs, it was shown that the presence of hydrophobic functionalities on the surface of the NPSNPs was the major governing factor controlling BMP-2 loading capacities regardless of the positive or negative charge of the terminal functional groups. Furthermore, BMP-2 delivery systems based on NPSNPs showed three types of BMP-2 release behaviour: fast initial (burst), sustained and slow release (retention), depending on the modification of the NPSNPs. Notwithstanding that the reasons for the different release behaviours could not be fully clarified yet and need further investigations, these results pave the way for engineered NPSNP-based delivery systems with desired growth factor release kinetics for tissue engineering. First studies on the potential for bone regeneration revealed that BMP-2-loaded NPSNPs were slightly more effective in upregulating early targeted gene expression in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after a short exposure time of 2 h as compared to free BMP 2. In addition, cytotoxicity investigations performed with all types of NPSNPs showed that all concentrations of non-modified NPSNPs, as well as all types of modified NPSNPs were not cytotoxic up to a concentration of 10 µg ml−1 towards mouse myoblasts (C2C12) cells and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells within a period of 7 days. With regard to the possible application to regenerate bone tissue in case of large bone defects or of a rupture of the tendon-bone junction, BMP-2-loaded NPSNPs with different modifications were successfully integrated into three-dimensional and porous scaffolds made up of either collagen or poly(ε-caprolactone) (PCL) fibres, respectively. As a result, biofunctionalised implants were developed providing a controlled release of small doses (nanogram range) of BMP-2. Despite the promising results, both collagen- and PCL-based scaffolds need further optimisation regarding the released amounts of BMP-2 to successfully induce osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.

Verletzungen des Bewegungsapparates, bestehend aus Knochen, Muskeln, Knorpel, Sehnen, Bändern, Gelenken und dem Bindegewebe, sind weltweit unter den häufigsten Ursachen für chronische Schmerzen und körperliche Funktionseinschränkungen. Klassische Therapiemethoden versagen oft bei der Wiederherstellung der Funktionalität des betroffenen Gewebes. Das Ziel des Tissue Engineerings ist es, die Chancen einer erfolgreichen Heilung und Regeneration der verletzten Gewebe und Gewebeübergänge zu verbessern. Die Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus einem Scaffold (Gerüst für das Wachstum von Gewebe) ist dabei einer der vielversprechenden Ansätze. In der vorliegenden Arbeit wurden komplexe Systeme auf der Basis von nanoporösen Silica-Nanopartikel (NPSNPs) zur kontrollierten Beladung und Freisetzung des Wachstumsfaktors bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) entwickelt, die im Bereich des Tissue Engineerings und der Regeneration vom Knochengewebe eingesetzt werden sollen. Sphärische NPSNPs wurden mit Hilfe des Tensid-gesteuerten Sol-Gel-Verfahrens hergestellt. Die Oberfläche der NPSNPs wurde nachträglich mittels post-synthetischer Reaktionen mit unterschiedlichen organischen Silankopplungsreagenzien verändert, um die Beladungsmenge und die Freisetzungskinetik von BMP-2 gezielt zu steuern. Vor der BMP-2-Beladung wurde festgestellt, dass auf der Oberfläche von aminopropylsilyl-modifizierten NPSNPs hydrolytisch stabile Spezies vorlagen, die einen Verschluss der Poren verursachten. Dieser Porenverschluss konnte in Folge weiterer postsynthetischer Reaktionen wieder rückgängig gemacht werden. Diese Ergebnisse sind entscheidend für die Weiterentwicklung der NPSNP-basierten Freisetzungs-systeme. Nach der Beladung von BMP-2 auf die Oberfläche von unterschiedlich modifizierten NPSNPs zeigte sich, dass die Anwesenheit von hydrophoben Funktionalitäten, ungeachtet der Ladung, ein entscheidendes Kriterium für eine erfolgreiche BMP-2-Beladung darstellte. Abhängig von der Oberflächenmodifizierung der NPSNPs zeigten die BMP-2-beladenen NPSNPs drei verschiedene Arten der Freisetzung: eine anfänglich schnelle (burst), eine konstante (sustained) oder eine langsame (retention) BMP-2-Freisetzung. Obwohl die Zusammenhänge zwischen der Art der funktionellen Gruppe und der Freisetzungskinetik nicht vollständig geklärt werden konnten und weiterer Untersuchungen bedürfen, bieten diese Ergebnisse einen ersten Ansatz für die Entwicklung von NPSNP-basierten Systemen für eine gezielte Freisetzung von Wachstumsfaktoren für die Anwendung im Bereich des Tissue Engineerings. Erste Zellkulturuntersuchungen von BMP-2-beladenen NPSNPs (verglichen mit ungebundenen BMP-2) zeigten eine gewisse Tendenz, die Expression von „frühen“ Genen, die auf eine anfängliche osteogene Differenzierung von Knochenmark-stammzellen hinweisen, auszulösen. Die Untersuchungen der Zelltoxizität von verschiedenen NPSNPs gegenüber Myoblasten und Knochenmarkstammzellen zeigten, dass die nicht modifizierten NPSNPs bei keiner der getesteten Konzentrationen und zu keinem Zeitpunkt zelltoxisch waren. Die unterschiedlich modifizierten NPSNPs hatten bis zur einen Konzentration von 10 µg ml−1 keinen zelltoxischen Effekt auf beide Zelllinien innerhalb von 7 Tagen. In Hinblick auf den gewünschten Einsatz zur Regeneration des Knochengewebes in großen Knochendefekten und in Knochen-Sehnen-Übergängen beschäftigte sich ein weiterer Teil der Arbeit mit der Herstellung von biofunktionalisierten Implantaten mit einer gezielten Freisetzung von kleinen Dosen von BMP-2 (Nanogramm) unter Zuhilfenahme von unterschiedlich modifizierten, BMP-2-beladenen NPSNPs und dreidimensionalen, porösen Scaffolds aus Kollagen- oder Poly(ε-caprolactone) (PCL)-Fasern. Trotz der ersten, vielversprechenden Ergebnisse bedürfen sowohl die Kollagen- als auch die PCL-basierten Freisetzungssysteme weiterer Optimierung bezüglich der freigesetzten BMP-2-Mengen, damit eine erfolgreiche osteogene Differenzierung von Stammzellen erreicht werden kann.