Entwicklung neuer Strategien für die Hochzelldichte-Kultivierung verschiedener Derivate von Escherichia coli

Abstract

Fed-Batch-Prozesse werden häufig für die Hochzelldichte-Kultivierung (HCDC) verschiedener Mikroorganismen und Bioreaktormaßstäbe eingesetzt. Während anspruchsvolle Strategien besonders in der Forschung Anwendung finden, stehen robuste Prozesse im Fokus industrieller Vorhaben. Basierend auf dem HCDC-Verfahren für E. coli (Riesenberg et al. 1991) wurden verschiedene Nachfütterungsstrategien für die Herstellung rekombinanter Proteine entwickelt. Die initiale Batch-Phase einer typischen HCDC führt bei Verwendung von Glucose als Kohlenstoffquelle häufig zur Akkumulation unerwünschter Nebenprodukte, wie Acetat. Ursächlich hierfür ist das Wachstum mit maximaler spezifischer Wachstumsrate und der daraus resultierende Überflussmetabolismus. Bei hohen Wachstumsraten steigt darüber hinaus der Bedarf an Sauerstoff. In großen Reaktoren mit limitiertem spezifischen Leistungseintrag kann somit bereits frühzeitig die Zugabe von reinem Sauerstoff erforderlich sein. Zusätzlich ist die Verwendung einiger auxotropher Stämme in der klassischen HCDC begrenzt. Darunter fällt beispielsweise der Leucin-auxotrophe E. coli K12 ER2507, bei dem bereits eine geringe Konzentration der erforderlichen Aminosäure zu einer deutlichen Reduktion der spezifischen Wachstumsrate führt. Beeinflusst wird das Wachstumsverhalten und der Leucinausbeutekoeffizient zudem von der Glucosekonzentration in der Suspension. Zusätzlich spielt im Hinblick auf die Mitarbeiter- und Konsumentensicherheit die Unbedenklichkeit der Medienkomponenten eine wichtige Rolle. Kritisch ist hier insbesondere der Einsatz von besonders besorgniserregenden Stoffen, wie Cobaltchlorid und Borsäure. Somit sollte bei der Entwicklung neuer Ansätze für die Hochzelldichte-Kultivierung von E. coli ein Augenmerk auf die Medienformulierung und die Probleme in der Batch-Phase gelegt werden. In dieser Arbeit gelang es mit dem iHCDC-Prozess, welcher durch eine Sequenz von ausschließlich Fed-Batch-Phasen gekennzeichnet ist, die Acetatbildung in der frühen Wachstumsphase zu unterbinden. Durch eine spezielle Variante der iHCDC konnte der Leucin-auxotrophe Stamm K12 ER2507 der Hochzelldichte-Kultivierung zugänglich gemacht werden. In einem weiteren Optimierungsschritt, als i²HCDC bezeichnet, wurde das Medium drastisch vereinfacht. Mit Ausnahme von KH2PO4 und Zusätzen für auxotrophe Stämme wurden alle Substanzen aus dem Startmedium entfernt und die Versorgung mit den wachstumsrelevanten Nährstoffen durch die Zugabe der Nachfütterungslösung realisiert. Zudem konnten toxische Bestandteile aus dem Konzentrat eliminiert werden ohne die Produktivität zu beeinflussen. Der i²HCDC-Prozess vereint Einfachheit, Reproduzierbarkeit und exakte zeitliche Planbarkeit und wurde für diverse Derivate wie BL21 (DE3), BL21, K12 TG1, M15 und K12 ER2507 mit und ohne Fremdprotein-Expression getestet.