Nucleotides are metabolites involved in primary metabolism, and specialized
metabolism and have a regulatory role in various biochemical reactions in all forms of life. While in other organisms, the nucleotide metabolome was characterized
extensively, comparatively little is known about the cellular concentrations of
nucleotides in plants. The aim of this dissertation was to investigate the nucleotide metabolome and enzymes influencing the composition and quantities of nucleotides in plants. For this purpose, a method for the analysis of nucleotides and nucleosides in plants and algae was developed (Chapter 2.1), which comprises efficient quenching of enzymatic
activity, liquid-liquid extraction and solid phase extraction employing a weak-anionexchange resin. This method allowed the analysis of the nucleotide metabolome of plants in great depth including the quantification of low abundant deoxyribonucleotides and deoxyribonucleosides. The details of the method were summarized in an article, serving as a laboratory protocol (Chapter 2.2).
Furthermore, we contributed a review article (Chapter 2.3) that summarizes the
literature about nucleotide analysis and recent technological advances with a focus on plants and factors influencing and hindering the analysis of nucleotides in plants, i.e., a complex metabolic matrix, highly stable phosphatases and physicochemical
properties of nucleotides. To analyze the sub-cellular concentrations of metabolites, a protocol for the rapid isolation of highly pure mitochondria utilizing affinity chromatography was developed (Chapter 2.4).
The method for the purification of nucleotides furthermore contributed to the
comprehensive analysis of the nucleotide metabolome in germinating seeds and in
establishing seedlings of A. thaliana, with a focus on genes involved in the synthesis of thymidilates (Chapter 2.5) and the characterization of a novel enzyme of purine nucleotide degradation, the XANTHOSINE MONOPHOSPHATE PHOSPHATASE (Chapter 2.6). Protein homology analysis comparing A. thaliana, S. cerevisiae, and H. sapiens led to the identification and characterization of an enzyme involved in the metabolite damage repair system of plants, the INOSINE TRIPHOSPHATE PYROPHOSPHATASE (Chapter 2.7). It was shown that this enzyme dephosphorylates deaminated purine nucleotide triphosphates and thus prevents their incorporation into nucleic acids. Lossof-function mutants senesce early and have a constitutively increased content of salicylic acid. Also, the source of deaminated purine nucleotides in plants was investigated and it was shown that abiotic factors contribute to nucleotide damage.
Nukleotide sind Metaboliten, die am Primärstoffwechsel und an spezialisierten
Stoffwechselvorgängen beteiligt sind und eine regulierende Rolle bei verschiedenen
biochemischen Reaktionen in allen Lebensformen spielen. Während bei anderen
Organismen das Nukleotidmetabolom umfassend charakterisiert wurde, ist in Pflanzen
vergleichsweise wenig über die zellulären Konzentrationen von Nukleotiden bekannt.
Ziel dieser Dissertation war es, das Nukleotidmetabolom und die Enzyme zu
untersuchen, die die Zusammensetzung und Menge der Nukleotide in Pflanzen
beeinflussen. Zu diesem Zweck wurde eine Methode zur Analyse von Nukleotiden und
Nukleosiden in Pflanzen und Algen entwickelt (Kapitel 2.1), die ein effizientes Stoppen
enzymatischer Aktivität, eine Flüssig-Flüssig-Extraktion und eine
Festphasenextraktion unter Verwendung eines schwachen Ionenaustauschers
umfasst. Mit dieser Methode konnte das Nukleotidmetabolom von Pflanzen eingehend
analysiert werden, einschließlich der Quantifizierung von Desoxyribonukleotiden und
Desoxyribonukleosiden mit geringer Abundanz. Die Einzelheiten der Methode wurden
in einem Artikel zusammengefasst, der als Laborprotokoll dient (Kapitel 2.2).
Darüber hinaus wurde ein Übersichtsartikel (Kapitel 2.3) verfasst, der die Literatur
über die Analyse von Nukleotiden und die jüngsten technologischen Fortschritte
zusammenfasst. Der Schwerpunkt lag hierbei auf Pflanzen und Faktoren, die die
Analyse von Nukleotiden in Pflanzen beeinflussen oder behindern, d. h. eine komplexe
Matrix, hochstabile Phosphatasen und physikalisch-chemische Eigenschaften von
Nukleotiden.
Um die subzellulären Konzentrationen von Metaboliten zu analysieren, wurde ein
Protokoll für die schnelle Isolierung hochreiner Mitochondrien unter Verwendung einer
Affinitätschromatographie entwickelt (Kapitel 2.4).
Die Methode zur Analyse von Nukleotiden trug außerdem zu einer umfassenden
Analyse des Nukleotidmetaboloms in keimenden Samen und in sich etablierenden
Keimlingen von A. thaliana bei, wobei der Schwerpunkt auf Genen lag, die an der
Synthese von Thymidilaten beteiligt sind (Kapitel 2.5), sowie zu der Charakterisierung
eines neuen Enzyms des Purinnukleotidabbaus, der XANTHOSINE
MONOPHOSPHATE PHOSPHATASE (Kapitel 2.6). Eine Proteinhomologieanalyse, die A. thaliana, S. cerevisiae und H. sapiens
miteinander verglich führte zur Identifizierung und Charakterisierung eines Enzyms,
das an der Reparatur von geschädigten Metaboliten in Pflanzen beteiligt ist, der
INOSINE TRIPHOSPHATE PYROPHOSPHATASE (Kapitel 2.7). Es konnte gezeigt
werden, dass dieses Enzym desaminierte Purinnukleotidtriphosphate
dephosphoryliert und so deren Einbau in Nukleinsäuren verhindert.
Funktionsverlustmutanten altern früh und weisen einen konstitutiv erhöhten Gehalt an Salicylsäure auf. Außerdem wurde die Quelle der desaminierten Purinnukleotide in Pflanzen untersucht, und es wurde gezeigt, dass abiotische Faktoren zur
Nukleotidschädigung beitragen.
