Gezielte Mutagenese mit Cas-Endonukleasen zur Etablierung von Bymovirus-Resistenzen in Gerste

Abstract

Seit der neolithischen Revolution haben Domestikation und Pflanzenzüchtung die vom Menschen angebauten Pflanzen grundlegend verändert - aus Wildpflanzen wurden Kulturpflanzen. Insbesondere ab dem 19. Jahrhundert intensivierten die ersten Pflanzenzüchterinnen und -züchter ihre Arbeit zur Verbesserung von Kulturpflanzen. Mit der aufkommenden wissenschaftlichen Disziplin der Genetik wuchs das Verständnis dafür, wie Eigenschaften vererbt und verändert werden. Die moderne Genomik mit der Sequenzierung von Pangenomen und leistungsfähiger Bioinformatik trägt wesentlich dazu bei, die genetischen Grundlagen dieser Eigenschaften und die Bedeutung genetischer Veränderungen immer besser zu verstehen. Mit der Genomeditierung steht heute ein Methodenset zur Verfügung, um Gene von Kulturpflanzen gezielt zu verändern, sowohl für die wissenschaftliche Untersuchung von Genfunktionen als auch für die züchterische Verbesserung von Pflanzen. Insbesondere die vom mikrobiellen Immunsystem CRISPR-Cas abgeleiteten Cas-Endonukleasen haben sich dabei als nützliches und praktikables Werkzeug erwiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 zur gezielten Mutagenese zweier bekannter Anfälligkeitsgene der Gerste gegen die Gelbmosaikvirose eingesetzt. Die Gelbmosaikvirose ist eine der bedeutendsten Krankheiten der Gerste (Hordeum vulgare L.) in Europa und Asien. Sie wird von den beiden Bymoviren Gerstengelbmosaikvirus (Barley Yellow Mosaic Virus, BaYMV) und Mildes Gerstenmosaikvirus (Barley Mild Mosaic Virus, BaMMV) verursacht. Mit Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E (EIF4E) und Protein Disulfide Isomerase-Like 5-1 (PDIL5-1) sind zwei Anfälligkeitsgene der Gerste bekannt, für die resistenzvermittelnde Allele beschrieben wurden. Derzeit sind fast alle Wintergerstensorten in Europa resistent gegen BaYMV und BaMMV, jedoch basieren diese Resistenzen fast ausschließlich auf den EIF4E-Allelen rym4 und rym5. Doch diese Resistenzen wurden bereits von angepassten Virusstämmen gebrochen, sodass ein Bedarf an neuen Resistenzvarianten und -mechanismen besteht. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue resistenzvermittelnde Allele von EIF4E zu generieren sowie die in Gerstenlandrassen beschriebenen, resistenzvermittelnden Allele von PDIL5-1 in anfälligen Genotypen zur reproduzieren. Dafür wurden beide Gene mittels Cas9 gezielt mutiert, wobei erfolgreich verschiedene Knockout- und Basenmutationen in PDIL5-1 sowie Knockout-Mutationen in EIF4E induziert werden konnten. Die Nachkommenschaften der Primärmutanten wurden manuell mit BaMMV infiziert und sowohl die Knockout-Mutationen in EIF4E und PDIL5-1 als auch die Basensubstitutionen in PDIL5-1 führten zur Resistenz gegen das Virus. Im Gegensatz zu PDIL5-1 ging der Knockout von EIF4E jedoch mit einer Reduktion des Kornertrags einher. Aus diesem Grund wurde für dieses Kandidatengen zusätzlich die Baseneditierung in Wintergerste etabliert. Mihilfe von Cas9-Derivaten, die gezielt C-zu-T- und A-zu-G-Basen-substitutionen induzieren, wurden so insgesamt zehn neue Allele von EIF4E erzeugt, die in nachfolgenden Arbeiten auf ihre resistenzvermittelnden Eigenschaften überprüft werden können. Die vorliegende Arbeit liefert konkrete Beispiele dafür, wie mithilfe der Genomeditierung Pflanzenforschung und -züchtung, insbesondere im Hinblick auf Krankheitsresistenzen, verbessert werden können. Mit den Methoden der gezielten Mutagenese ist es möglich, Genvarianten für vorteilhafte Eigenschaften, die in der Kulturpflanzenvielfalt (z.B. in Genbanken) mithilfe der Hochdurchsatzsequenzierung und modernen Methoden der Genetik immer schneller gefunden werden, für die Pflanzenzüchtung nutzbar zu machen. Damit kann ein wesentlicher Beitrag für eine nachhaltigere Landwirtschaft geleistet werden.

Since the Neolithic Revolution, domestication and plant breeding have extensively changed the shape of the plants cultivated by humans - wild plants became crop plants. Especially from the 19th century onwards, the first plant breeders intensified their work on crop plant improvement and with genetics as an emerging scientific discipline, they increasingly understood how traits are inherited and modified. Modern genomics, with sequencing of pangenomes and powerful bioinformatics, is playing a major role in helping understand the genetic basis of these traits and the significance of genetic changes. With gene editing, a whole suite of methods is now available to specifically modify genes of crop plants. In particular, CRISPR-associated (Cas) endonucleases derived from the microbial CRISPR-Cas immune system have been proven to be a useful and practical tool. In the present work, the Cas9 endonuclease was used for targeted mutagenesis of two previously known susceptibility genes of barley against the barley yellow mosaic disease. Caused by the Barley yellow mosaic virus (BaYMV) and the Barley mild mosaic virus (BaMMV), the barley yellow mosaic disease is one of the most important viral diseases of barley (Hordeum vulgare L.) in Europe and Asia. With the Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E (EIF4E) and the Protein Disulfide Isomerase-Like 5-1 (PDIL5-1), two susceptibility genes of barley are known for which resistance-conferring alleles have already been described. Currently, almost all winter barley varieties in Europe are resistant to BaYMV and BaMMV, but this resistance is based almost exclusively on the EIF4E alleles rym4 and rym5. However, this resistance has already been overcome by some adapted virus strains, which is why there is an urgent need for new resistance variants and mechanisms. Therefore, the aim of this work was to generate new resistance-mediating alleles of EIF4E and to reproduce in susceptible genotypes the resistance-mediating alleles of PDIL5-1 that have been described in barley landraces. For this purpose, both genes were specifically mutated using Cas9, successfully inducing different knockout and base mutations in PDIL5-1 as well as knockout mutations in EIF4E. The progeny of the primary mutants was mechanically infected with BaMMV and both the Knockout mutations in EIF4E and PDIL5-1 and the base substitutions in PDIL5-1 resulted in resistance to the virus. However, unlike PDIL5-1, knockout of EIF4E was accompanied by a reduction in grain yield. For this reason, base editing was established in winter barley for this candidate gene. Using Cas9 derivatives that specifically induce C-to-T and A-to-G base substitutions, a total of ten new alleles of EIF4E were generated which can be tested for their resistance-mediating properties in subsequent work. The present work provides concrete examples of how gene editing can be used to improve plant research and plant breeding, especially with regard to disease resistance. With the methods of targeted mutagenesis, it is possible to deploy beneficial gene variants which are being found ever faster by taking advantage of the crop diversity (e.g. in gene banks) and with the help of high-throughput sequencing and modern methods of genetics. This is expected to make a significant contribution to more sustainable agriculture.