Programmierbare Endonukleasen sind wirksame Werkzeuge für die Pflanzenforschung und Biotechnologie-gestützte Pflanzenzüchtung. Das in der vorliegenden Arbeit entwickelte modulare Vektorsystem CasCADE erlaubt einen schnellen und einfachen Zusammenbau von komplexen Vektoren für die Expression von RNA-geleiteten, Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated (Cas) -Endonukleasen zur Genomeditierung mono- und dikotyler Pflanzenarten. Es besteht die Möglichkeit, bis zu vier verschiedene gRNA-codierende Expressionseinheiten in einem Vektor zusammenzustellen. Bezüglich der Expressionseinheit für die Cas-Endonuklease umfasst das Vektorsystem eine Vielzahl frei kombinierbarer Modulvarianten für Promotoren, codierende Sequenzen diverser cas9-Derivate, translationale Fusionselemente, Terminatoren und variabel besetzbare Positionen. Die unterschiedlichen Module einschließlich einiger bereits vorliegender Endonuklease-Expressionseinheiten lassen sich in insgesamt drei Golden-Gate-Klonierungsschritten zu vollständigen gRNA/cas9-Expressionsvektoren kombinieren, die für den direkten DNA-Transfer in Pflanzenzellen genutzt werden können. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, alle funktionellen Elemente solcher Plasmide in einem Schritt in kompatible generische Binärvektoren mit unterschiedlichen Selektionsmarkergenen für die Agrobakterien-vermittelte Pflanzentransformation zu übertragen. Anhand der gezielten Mutagenese der Sugar transport protein 13 (Stp13) -Orthologe von Weizen und Gerste wurde das CasCADE-System exemplarisch validiert. Grundlage dafür ist das vom Weizen bekannte, Resistenz-vermittelnde Lr67res-Allel dieses Zuckertransporters, das trotz seiner universellen und stabilen Wirksamkeit gegen Schwarz-, Braun- und Gelbrost sowie Mehltau aufgrund der genetischen Kopplung mit dem Reduced height 1 Wildtyp-Allel für die Züchtung moderner, kurzstrohiger Sorten bislang nicht erschlossen werden konnte. Unter Verwendung des CasCADE-Systems wurde eine breite Palette neuer allelischer Varianten in Weizen und Gerste erzeugt, die prinzipiell auf die gleiche Weise wie Lr67res Resistenz verleihen könnten. In vorläufigen Tests erwiesen sich einige der generierten Gerstenmutanten als resistent gegen den Braunrostpilz. Die im Rahmen der vorliegenden Studie erzeugten Gersten- und Weizenmutanten stellen eine aussichtsreiche Grundlage für die Erforschung des Lr67-Resistenzmechanismus und die Entwicklung pilzresistenter Sorten dar.
Programmable endonucleases are effective tools for plant research and biotechnology-assisted plant breeding. Given the rapid advancement of genome editing and the ever-increasing diversity of functional elements available for it, the laborious generation of transformation vectors is a crucial limitation. The modular vector system CasCADE developed in the present work facilitates the rapid and simple assembly of complex vectors for the expression of RNA-guided, Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated (Cas) endonucleases for genome editing of mono- and dicotyledonous plant species. Different RNA polymerase III promoters are available for gRNA expression and it is possible to assemble up to four different gRNA-coding expression units in one vector. With regard to the expression unit for the Cas endonuclease, the vector system comprises a large number of freely combinable module variants for promoters, coding sequences of various cas9 derivatives, translational fusion elements and terminators. In addition, a completely variable position is provided for any separate element, such as the expression unit for a fluorescent protein. The different modules including some already existing endonuclease expression units can be combined in a total of three Golden Gate cloning steps to form complete gRNA/cas9 expression vectors that can be used for direct DNA transfer into plant cells. Furthermore, it is possible to transfer all functional elements of such plasmids in one step into compatible generic binary vectors with different selection marker genes for Agrobacterium-mediated plant transformation. The CasCADE system was validated exemplarily by targeted mutagenesis of the Sugar transport protein 13 (Stp13) orthologs of barley and wheat. This approach relied on the resistance-conferring Lr67res allele of the STP13 sugar transporter known from wheat, which, despite its universal and stable efficacy against leaf, stem and stripe rust as well as powdery mildew, has not yet been exploited for breeding of modern, short-straw varieties due to genetic linkage with the Reduced height 1 wild-type allele. Using the CasCADE system, a wide range of new Stp13 allelic variants were generated in wheat and barley that could in principle confer resistance in the same way as Lr67res. In preliminary tests, some of the generated barley mutants were found indeed to be resistant to the leaf rust fungus. The barley and wheat mutants generated in the present study provide a promising basis for research on the Lr67 resistance mechanism and the development of varieties with broad and durable resistance to fungal diseases.
