Biocatalytic production of bioactive dipeptides

Abstract

Dipeptides are a promising substance class with a large variety of bioactivities. N-terminal arginyl dipeptides (Arg-X) have been shown to exhibit both salt-taste enhancing (Arg-Ser among others) and antihypertensive properties (Arg-Phe). A novel biocatalytic strategy for the specific synthesis of these dipeptides is the application of L-amino acid ligases like RizA from B. subtilis, which enables production of Arg-X dipeptides directly from their amino acids. However, challenges for an industrial application are the dependence on the expensive cofactor ATP (adenosine triphosphate), low product yields, formation of the undesired side product Arg Arg and the potentially high enzyme costs. In order to reduce the need for ATP, a strategy for ATP regeneration from acetyl phosphate was established using acetate kinase from E. coli (AckA). Up to 5.9 g/L Arg-Ser were produced, corresponding to an ATP efficiency of 23 g Arg-Ser per gram ATP (without regeneration max. 0.5 g Arg-Ser/g ATP). Next, variants of RizA were created to alter the substrate specificity. A total of 21 RizA variants were created by site-directed mutagenesis of eight positions in the substrate binding pocket. Additional 14 variants were created by combination of different mutations. Variants with improved activity and specificity were identified for all five examined amino acid combinations (Arg + Arg, Asp, Ser, Ala, Phe). The largest change was observed for K83F_S156A, which improved the product formation of Arg-Phe six-fold and improved specificity more than ten fold. Finally, co immobilization of RizA and selected variants with AckA was performed to enable reusability of this biocatalytic system. Immobilisates of T81F_A158S produced up to 3.0 g/L Arg Ser and immobilisates of K83F_S156A produced up to 3.8 g/L Arg-Phe and could both be reused several times. This thesis represents the first extensive scientific investigation into establishing ATP regeneration for an L-amino acid ligase and co-immobilization of such a biocatalytic system, and substantially expanded the knowledge about engineering the substrate specificity of L amino acid ligases.

Dipeptide sind eine vielversprechende Substanzklasse mit einer großen Bandbreite verschiedener Bioaktivitäten. Für N-terminale Arginyldipeptide (Arg-X) wurden sowohl salzgeschmacksverstärkende (u. a Arg-Ser) als auch antihypertensive Eigenschaften (Arg Phe) nachgewiesen. Eine neuartige biokatalytische Strategie für die spezifische Synthese dieser Dipeptide ist die Nutzung von L-Aminosäureligasen wie RizA aus B. subtilis, welche es ermöglicht Arg-X Dipeptide direkt aus den Aminosäuren zu synthetisieren. Hindernisse für einen industriellen Einsatz sind allerdings die Abhängigkeit von dem teuren Kofaktor ATP (Adenosintriphosphat), niedrige Produktausbeuten, die Bildung von unerwünschtem Arg-Arg als Nebenprodukt und die potenziell hohen Enzymkosten. Um den Bedarf an ATP zu senken, wurde eine Strategie zur ATP-Regenerierung aus Acetylphosphat mittels Acetatkinase aus E. coli (AckA) etabliert. Bis zu 5.9 g/L Arg-Ser wurden produziert, was einer ATP-Effizienz von 23 g Arg-Ser pro Gramm ATP entsprach (ohne Regenerierung maximal 0.5 g Arg-Ser/g ATP). Als nächstes wurden Varianten von RizA erzeugt, um die Substratspezifität zu beeinflussen. Insgesamt 21 RizA-Varianten wurden mittels positionsgerichteter Mutagenese von acht Positionen in der Substratbindetasche erzeugt. Weitere 14 Varianten wurden durch Kombination verschiedener Mutationen erzeugt. Varianten mit verbesserter Aktivität und Spezifität wurden für alle fünf betrachteten Aminosäurekombinationen (Arg + Arg, Asp, Ser, Ala oder Phe) gefunden. Der größte Unterschied wurde für K83F_S156A erhalten, welches die Produktbildung von Arg-Phe im Vergleich zum Wildtypenzym versechsfachte und die Spezifität mehr als verzehnfachte. Schließlich wurde eine Ko-Immobilisierung von RizA und ausgewählten Varianten mit AckA durchgeführt, um die Wiederverwendbarkeit dieses biokatalytischen Systems zu ermöglichen. Immobilisate von T81F_A158S produzierten bis zu 3,0 g/L Arg-Ser und Immobilisate von K83F_S156A produzierten bis zu 3.8 g/L Arg-Phe und konnten beide mehrfach wiederverwendet werden. Diese Arbeit stellt die erste umfassende wissenschaftliche Untersuchung zur Etablierung einer Regenerierung von ATP für eine L-Aminosäureligase und die Ko-Immobilisierung eines solchen Systems dar und hat das Wissen über das engineering der Substratspezifität von L Aminosäureligasen wesentlich erweitert.