Towards understanding the mechanisms of the periplasmic pyoverdine maturation

Abstract

Iron plays an essential role in the maintenance of various vital processes. Therefore, obtaining iron, especially under adverse conditions, is an elementary component for the survival of microorganisms. Bacteria produce so-called siderophores, which help to procure iron in iron-limiting environments. The siderophores of fluorescent pseudomonads are called pyoverdines. During this work, the enzymes involved in the periplasmic maturation of pyoverdines have been further characterized towards a better understanding of their respective mechanisms. PvdM was shown to be essential for the activity of PvdP in vivo. The putative role of PvdM here could be either a kind of handover mechanism of the substrate ferribactin to PvdP. Alternatively, PvdM could be directly involved in the incorporation of copper by presenting copper on its surface to PvdP, which is essential for the reaction of the tyrosinase PvdP. Furthermore, it could be shown that PvdP appears not to be an enzyme liberated into the periplasm after the translocation as previously assumed, but to catalyse the oxidative cyclization of the chromophore as a membrane-bound protein. Responsible for this seems to be the signal peptide of PvdP, which appears to be one of only a few Tat-signal peptides known to date, that is not cleaved after translocation but rather involved in the integration of the protein into the cytoplasmic membrane. In parallel, the actual conversion of the N-terminal glutamic acid residue of pyoverdine by PvdN was demonstrated. Thereby, the role of PvdN in the periplasmic maturation process was finally confirmed. Furthermore, glutamine was identified as a new substrate, eliminating the need for the laborious purification of pyoverdine for future enzymatic studies of PvdN. This realisation will make conversion experiments and detection much easier and faster in the future. In addition, oxygen was shown to be indispensable for the catalytic reaction of PvdN, which supports the postulated unusual PLP-dependent oxidative decarboxylation under the retention of the amine (Ringel et al. 2016). Finally, it was demonstrated that growth is possible in medium depleted with the iron chelator EDDHA, even though pyoverdine synthesis is eliminated. In this context, a modified form of EDDHA was detected, which is dimethylated and thus probably facilitates the release of bound iron by having two out of six ligand sites modified.

Eisen spielt eine wesentliche Rolle bei der Erhaltung verschiedener Lebensprozesse. Daher ist die Gewinnung von Eisen, insbesondere unter widrigen Bedingungen, ein elementarer Bestandteil für das Überleben von Mikroorganismen. Bakterien produzieren sogenannte Siderophore, die bei der Eisenbeschaffung in eisenlimitierenden Umgebungen helfen. Die Siderophore der fluoreszierenden Pseudomonaden werden Pyoverdine genannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Enzyme, die an der periplasmatischen Maturierung der Pyoverdine beteiligt sind, weiter charakterisiert, um ihre jeweiligen Mechanismen besser zu verstehen. Es wurde gezeigt, dass PvdM essenziell für die Aktivität der Tyrosinase PvdP in vivo ist. PvdM könnte hier in eine Art Übergabemechanismus des Substrats Ferribactin an PvdP involviert oder aber direkt am Einbau von Kupfer beteiligt sein, indem es Kupfer auf seiner Oberfläche an PvdP weitergibt, welches für dessen Reaktion unerlässlich ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass PvdP nicht, wie bisher angenommen, nach der Translokation ins Periplasma entlassen wird, sondern wahrscheinlich als membrangebundenes Protein die oxidative Zyklisierung des Chromophors katalysiert. Verantwortlich dafür scheint das Signalpeptid von PvdP zu sein, das als eines der wenigen bisher bekannten Tat-Signalpeptide nicht abgespalten wird, sondern an der Integration des Proteins in die innere Membran beteiligt ist. Parallel dazu wurde die tatsächliche Umwandlung des N-terminalen Glutamatrestes von Pyoverdin durch PvdN nachgewiesen und die Rolle von PvdN im periplasmatischen Maturierungsprozess endgültig bestätigt. Darüber hinaus wurde Glutamin als neues Substrat identifiziert, wodurch die mühsame Reinigung von Pyoverdin für künftige enzymatische Untersuchungen von PvdN überflüssig wird. Experimente und Nachweise werden zukünftig wesentlich einfacher und schneller. Es konnte gezeigt werden, dass Sauerstoff für die Katalyse von PvdN unverzichtbar ist. Dies unterstützt die postulierte PLP-abhängige oxidative Decarboxylierung unter Erhaltung des Amins (Ringel et al. 2016). Schließlich konnte gezeigt werden, dass Wachstum in mit dem Eisenchelator EDDHA depletierten Medium möglich ist, obwohl die Pyoverdinsynthese unterbunden wird. In diesem Zusammenhang wurde eine modifizierte Form von EDDHA nachgewiesen, welche dimethyliert ist und somit wahrscheinlich die Freisetzung des gebundenen Eisens erleichtert.