Intraspezifische Variabilität alkenspaltender Enzymaktivitäten in monokaryotischen und dikaryotischen Stämmen von Pleurotus sapidus

Abstract

Viele kleine Aldehyde und Ketone sind Aromastoffe mit hohem Wert für die Aromenindustrie. Diese können beispielsweise über die Spaltung analoger Alkene gebildet werden. Biotechnologische Ansätze sind von hohem industriellem Interesse, da sie zur Bildung natürlicher Aromastoffe führen, welche vom Verbraucher besonders im Lebensmittelbereich deutlich bevorzugt werden. Ein alkenspaltendes Enzym aus Pleurotus sapidus (PsaPOX), das das Arylalken trans-Anethol zu dem Aromastoff p-Anisaldehyd transformiert, wurde als Dye-decolorizing Peroxidase (DyP) identifiziert. Die DyP wurde heterolog produziert und biochemisch charakterisiert. PsaPOX enfärbte β-Carotin und Annatto. Biotransformationsexperimente verifizierten weiterhin die alkenspaltende Aktivität von PsaPOX gegenüber trans-Anethol, welche in Gegenwart von Mn2+ erhöht wurde, sowie gegenüber (E)-Methylisoeugenol und α-Methylstyren, die als Vorläufer von Veratrumaldehyd und Acetophenon dienten. PsaPOX ist die erste beschriebene DyP, für die eine alkenspaltende Aktivität gegenüber Arylalkenen nachgewiesen werden konnte. Für die Optimierung der Aktivität von PsaPOX wurde eine Tochtergeneration von 100 monokaryotischen P. sapidus-Stämmen erzeugt, die sich bezüglich der Wachstumsrate, Peroxidase- und alkenspaltenden Aktivität unterschieden. Die intraspezifische Variabilität der Enzymaktivitäten war stabil, wobei zehn Stämme höhere Aktivitäten als der parentale Dikaryot aufwiesen. Die intraspezifische Variabilität konnte auf die Existenz von drei Enzymvarianten zurückgeführt werden, die sich in ihrer spezifischen Aktivität und Stabilität unterschieden. Weiterhin resultierte die stark erhöhte Enzymaktivität eines der Monokaryoten aus einer erhöhten Expression des entsprechenden PsaPOX-Gens. Die Lipoxygenase LOXPsa1 wurde als weiteres alkenspaltendes Enzym von P. sapidus identifiziert. Dieses spaltete das Pfefferalkaloid Piperin in Gegenwart von mehrfach ungesättigten Fettsäuren co-oxidativ zu den Vanille-Aromen Piperonal und 3,4-Methylen-dioxyzimtaldehyd. Durch die Anpassung der Reaktionsparameter wurden die Ausbeuten mit dem rekombinanten Enzym optimiert. Die zuvor generierten monokaryotischen P. sapidus-Stämme zeigten auch für die Piperinkonversion eine intraspezifische Diversität.

Many small aldehydes and ketones are aroma compounds that are valuable for the flavor and fragrance industry. These can be formed by the cleavage of analogous alkenes. Biotechnological approaches are of high interest as they yield natural aroma compounds, which are preferred by the consumers especially in the food area. An alkene cleaving enzyme from Pleurotus sapidus (PsaPOX), which transforms the aryl alkene trans-anethole to the aroma compound p-anisaldehyde, was identified as dye-decolorizing peroxidase (DyP). The DyP was produced heterologously and biochemically characterized. PsaPOX bleached β-carotene and annatto. Furthermore, biotransformation experiments verified the alkene cleaving activity of PsaPOX towards trans-anethole, which was increased in the presence of Mn2+, and also towards (E)-methyl isoeugenol and α-methylstyrene, which yielded veratraldehyde and acetophenone, respectively. PsaPOX is the first described DyP with an alkene cleaving activity towards aryl alkenes. To optimize the activity of PsaPOX, a daughter-generation of 100 monokaryotic P. sapidus strains was generated. These strains differed in growth rate, peroxidase and alkene cleaving activity. The intraspecific variability of the enzyme activities was stable, with ten strains showing higher activities than the parental dikaryon. Sequence analysis and heterologous expression identified the intraspecific variability as result of the existence of three enzyme variants, which differed regarding their specific activities and stabilities. Furthermore, the strongly increased activity of one of the monokaryotic strains resulted from the higher expression of the corresponding PsaPOX gene. The lipoxygenase LOXPsa1 was identified as additional alkene cleaving enzyme from P. sapidus. It cleaved the pepper alkaloid piperine co-oxidatively to the vanilla-like aroma compounds piperonal and 3,4-methylenedioxycinnamaldehyde. The product concentrations were optimized for the biotransformation with the recombinant enzyme. The monokaryotic P. sapidus strains, which were generated before, showed an intraspecific diversity also for the piperine conversion.