Bacterial endophytes in apple (Malus domestica) rootstocks grown in apple replant disease affected and non-affected soils

Abstract

Die Apfelnachbaukrankheit (ARD) ist ein komplexes Phänomen, das Apfelplantagen und Baumschulen weltweit betrifft. Sie tritt auf, wenn Apfel wiederholt am gleichen Standort gepflanzt wird, was zu einer Reduzierung des Wachstums sowie des Ertrags und der Fruchtqualität führt. Trotz jahrzehntelanger Forschung ist die Ätiologie nur unzureichend verstanden. Da jedoch die Desinfektion des Bodens zu einem verbesserten Pflanzenwachstum führt, wird von einer Beteiligung des Boden(mikro)bioms ausgegangen. Organismen können Wurzeln von der Rhizosphäre aus besiedeln, werden dann zu so genannten Endophyten und können einen großen Einfluss auf das Pflanzenwachstum haben, sowohl negativ als auch positiv. Allerdings ist bis heute wenig über die Rolle der Endophyten in Bezug auf ARD bekannt. In dieser Arbeit wird die Hypothese geprüft, dass sich das bakterielle endophytische Mikrobiom in den Wurzeln von Pflanzen, die in von der Nachbaukrankheit betroffenen Böden wachsen, ivon dem in nicht betroffenen Böden unterscheidet. Daher wurde in drei Jahren ein Gewächshaus-Biotest durchgeführt, in dem M26-Apfelpflanzen entweder in unbehandelten ARD-Boden oder in gammabestrahlten ARD-Boden von drei verschiedenen Standorten gepflanzt wurden. Die Ergebnisse zeigten ein besseres Pflanzenwachstum in den bestrahlten Bodenvarianten. Um die Struktur der endophytischen bakteriellen Gemeinschaft in den Wurzeln zu analysieren, wurden oberflächendesinfizierte Wurzeln dieser Pflanzen für einen kulturunabhängigen 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierungsansatz verwendet. Es zeigte sich, dass Proteobakterien das dominierende Phylum in allen Varianten waren. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die Gattung Streptomyces mit ARD assoziiert war. Mehrere „Amplicon Sequence Variants“ (ASVs), die zu dieser Gattung gehören, waren in Wurzeln, die in ARD-Boden von verschiedenen Standorten wuchsen, sehr abundant und negativ mit der Sprosslänge und der Sprossfrischmasse korreliert. Die gleichen ASVs wurden auch in Wurzeln von Pflanzen gefunden, die im Feld in ARD-Boden wuchsen. Weiterhin wurde festgestellt, dass diese ASVs im Laufe der Zeit nach der Pflanzung in gesundem Boden in ihrer Abundanz zunahmen. Ob jedoch diese ASVs der Gattung Streptomyces ursächlicher Teil des ARD-Komplexes sind oder nur Opportunisten, bleibt unbeantwortet. Zusätzlich wurden in einem kulturabhängigen Ansatz 150 verschiedene bakterielle Isolate gewonnen, die 29 verschiedenen Gattungen und 69 verschiedenen Arten zugeordnet werden konnten. Mit 25 verschiedenen Arten war Pseudomonas die dominante und diverseste Gattung. Diese Isolate dienen als zukünftige Inokula, um nicht nur mögliche ARD-Verursacher, sondern auch pflanzenwachstumsfördernde Endophyten zu finden, die bei der Überwindung von ARD helfen könnten. Das Verständnis der Bedeutung der endophytischen Bakteriengemeinschaft in den Wurzeln im Zusammenhang mit ARD wird helfen, die Ätiologie von ARD zu entschlüsseln und mögliche Gegenmaßnahmen zu entwickeln.

The apple replant disease (ARD) is a complex phenomenon, which affects apple orchards and nurseries worldwide. It occurs when apple is repeatedly planted at the same site, leading to growth depressions and reductions in fruit yield and quality. Despite decades of research, the etiology is poorly understood. However, since soil disinfection leads to improved plant growth, soil (micro)biota are known to be involved. Microbes can colonize roots from the rhizosphere, become so called endophytes, and can have a huge impact on plant growth, which may be negative or positive. But up to date, little is known about the role of endophytes in relation to ARD. In this study we hypothesized that the bacterial endophytic microbiome differs in roots of plants growing in replant affected soil from that in roots growing in non-affected soil. Therefore, a greenhouse biotest was conducted in three years, in which M26 apple plants were planted either into untreated ARD soils or gamma irradiated ARD soils from three different sites. Results showed an increased plant growth in irradiated soil variants. To analyze the endophytic bacterial community structure in roots, surface disinfected roots from these plants were used for a culture independent 16S rRNA amplicon sequencing approach. Results showed that Proteobacteria were the dominant phylum in all variants. Interestingly, the genus Streptomyces was shown to be associated with ARD. Several amplicon sequence variants (ASVs) linked to this genus were highly abundant in roots grown in ARD soil from different sites and were negatively correlated to shoot length and shoot fresh mass. The same ASVs were also found in roots of plants growing in ARD soil in the field and were further found to be increasing in their abundance over time after planting in virgin soil. However, whether these members of the genus Streptomyces are causal part of the ARD complex or just opportunists remains unanswered. Moreover, in a culture dependent approach, 150 different isolates were obtained, belonging to 29 different genera with 69 different bacterial species. With 25 different species, Pseudomonas was the dominant and most diverse genus. These isolates serve as future inocula to find not only possible ARD causal agents, but also plant growth promoting endophytes, which might help to overcome ARD. Understanding the role of the endophytic bacterial community in the roots in the context of ARD will help to unravel the etiology of ARD and to develop possible countermeasures.