Einsatz Aptamer-modifizierter Gold-Nanopartikel in der Diagnostik

Abstract

Ein Lateral Flow Assay (LFA) ermöglicht eine schnelle Detektion von Krankheitserregern, Hormonen oder Verunreinigungen. Gleichzeitig sind LFAs kostengünstig und einfach anwendbar, so dass sie auch von nicht fachkundigen Personen durchgeführt werden können. In der vorliegenden Dissertation sollte ein Lateral Flow Assay entwickelt werden, der Aptamere bzw. Oligonukleotide anstelle der standardmäßig eingesetzten Antikörper als Detektionsmoleküle verwendet. Als diagnostisches Target wurde das Mykotoxin Ochratoxin A ausgewählt, das von Schimmelpilzen produziert wird und Lebensmittel verunreinigen kann. Zunächst wurde ein geeignetes Aptamer zur Detektion von Ochratoxin A ausgewählt. Dazu wurde die Affinität mithilfe der Microscale Thermophorese und Microarrays bestimmt. Für die Detektion des Mykotoxins auf einem Lateral Flow Assay wird ein zum Aptamer komplementäres Oligonukleotid (cOligo) benötigt, da der Assay auf einer Verdrängung des cOligos durch das Ochratoxin A beruht. Die Affinität des cOligos zum Aptamer sowie seine kompetitive Verdrängung durch Ochratoxin A wurde mit den gleichen Methoden untersucht. Der spätere Assay soll mithilfe einer optischen Testlinie, unter Verwendung von Gold-Nanopartikeln zur Signalgebung, ausgewertet werden. Diese Partikel wurden mithilfe verschiedener Methoden synthetisiert und durch die Rasterelektronenmikroskopie sowie UV-Vis-Spektroskopie analysiert. Für weitere Versuche wurden homogene Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser kleiner als 20 nm verwendet. Mit Thiol-modifizierten Oligonukleotiden wurden die Gold-Nanopartikel funktionalisiert und die Konjugate mittels UV-Vis-Spektroskopie und Dynamischer Lichtstreuung charakterisiert. Zur Überprüfung der Funktionalität der Konjugate wurde ein Bindungsassay der 3 Bindungspartner in Lösung entwickelt sowie Dot Blots mit immobilisierten Bindungspartnern durchgeführt. Abschließend wurde der Versuchsaufbau auf einen Lateral Flow Assay übertragen.