Translating the information encoded in messenger RNAs (mRNAs) into functional proteins is an essential cellular process carried out by large molecular machines termed ribosomes. Ribosomes are large ribonucleoprotein (RNP) particles, whose biogenesis is an energetically demanding and highly regulated process. During the early stages of ribosome biogenesis, the ribosomal RNAs (rRNAs) get covalently modified. One of the most abundant of these covalent modifications is the methylation of the 2’ hydroxyl group of the ribose (2’-O-Me) in specific nucleotides of the rRNA. Many of these 2’-O-methylated sites are located in functionally important regions of the matured ribosome, such as the peptidyl transferase center (PTC) or the decoding center. Unsurprisingly, aberrations in 2’-O-Me are associated with pathological developments such as cancer and neurological diseases in human. In archaea and eukaryotes 2’-O-Me modifications on rRNA are transferred by the Box C/D enzymes, which are multi-component RNPs that use guide RNAs to mediate site specific 2’-O-methylation on rRNA. Most of the available structural and functional data on the Box C/D RNP enzymes are based on the archaeal enzyme. Conversely, only little is known on the structural and functional details of the eukaryotic Box C/D enzyme. Therefore, the archaeal system is being used as a structural and functional proxy for the eukaryotic enzyme.
To expand to structural and functional knowledge about the eukaryotic Box C/D small nucleolar ribonucleoprotein (snoRNP) enzymes and examine the validity of the archaeal enzymes as a proxy I used a combination of biochemical, analytical and structural methods to analyze and characterize two subcomplexes of the eukaryotic Box C/D snoRNP from S. cerevisiae in vitro. Using fluorescence-based electrophoretic mobility shift assays I could characterize the binding requirements and affinities between the eukaryotic and archaeal Box C/D primary RNA-binding protein Snu13 and L7Ae, respectively, and the lesser conserved of two protein binding motifs on the Box C/D guide RNA. I also present the first high-resolution structure of archaeal L7Ae in complex with a non-standard Box C/D protein binding motif solved by X-ray crystallography. Using a combination of quantitative mass spectrometry, multi-angle light scattering and radioactivity-based enzymatic assays I determined the stoichiometries of in vitro reconstituted chimeric Box C/D enzymes based on different guide RNAs, demonstrating a potentially different structural arrangement in eukaryotic Box C/D enzymes as compared to archaeal enzymes. Lastly, the high-resolution structure of the eukaryotic 2’-O-methyltransferase Nop1 in complex with the scaffolding protein Nop56 from the Box C/D enzyme solved by X-ray crystallography highlights significant differences to the archaeal orthologs. The presented data expands the structural and functional information on the eukaryotic Box C/D and suggest together with exiting literature substantial differences between eukaryotic and archaeal Box C/D enzymes.
Die Übersetzung der in Messenger-RNAs kodierten Informationen in Proteine ist ein wesentlicher zellulärer Prozess, der von Ribosomen ausgeführt wird. Ribosomen sind große Ribonukleoprotein (RNP) -Partikel, deren Biogenese ein energetisch anspruchsvoller und stark regulierter Prozess ist. In den frühen Stadien der Ribosomenbiogenese werden die ribosomalen RNAs kovalent modifiziert. Eine der am häufigsten vorkommenden dieser kovalenten Modifikationen ist die Methylierung der 2'-Hydroxylgruppe der Ribose (2'-O-Me) in spezifischen Nukleotiden der rRNA. Viele dieser 2'-O-methylierten Stellen befinden sich in funktionell wichtigen Regionen des Ribosoms. Aberrationen bei 2'-O-Me sind mit Krebs und neurologischen Erkrankungen beim Menschen verbunden. In Archaeen und Eukaryoten werden 2'-O-Me-Modifikationen auf rRNA durch die Box C/D-Enzyme übertragen, bei denen es sich um Mehrkomponenten-RNPs handelt, die Leit-RNAs verwenden, um positionsspezifische 2'-O-Methylierung auf rRNA zu vermitteln. Der Großteil der verfügbaren Daten zu den Box C/D RNP-Enzymen basiert auf dem archaealen Enzymen und nur wenig ist über die strukturellen und funktionellen Details des eukaryotischen Box C/D-Enzyms bekannt, weswegen das archaeale System als Modell für das eukaryotische Enzym verwendet wird.
Um das Wissen über die eukaryotischen Box C/D Enzyme zu erweitern und die Gültigkeit der archaealen Enzyme als Modell zu untersuchen, verwendete ich eine Kombination aus biochemischen, analytischen und strukturellen Methoden, um zwei Subkomplexe des eukaryotische Box C/D Enzyms von S. cerevisiae in vitro zu charakterisieren. Unter Verwendung fluoreszenzbasierter elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungstests konnte ich die Bindungsanforderungen und -affinitäten zwischen dem eukaryotischen und dem archaealen Box C/D-RNA-Bindeprotein Snu13 bzw. L7Ae und dem weniger konservierten von zwei Proteinbindungsmotiven auf der Box C/D Leit-RNA charakterisieren. Ich präsentiere die erste hochauflösende Struktur von archaealem L7Ae im Komplex mit einem nicht standardmäßigen Box C/D Proteinbindungsmotiv, gelöst mit Röntgenkristallographie. Unter Verwendung einer Kombination aus quantitativer Massenspektrometrie, Mehrwinkellichtstreuung und enzymatischen Assays bestimmte ich die Proteinstöchiometrien von in vitro rekonstituierten chimären Box C/D-Enzymen und zeige eine möglicherweise unterschiedliche strukturelle Anordnung in eukaryotischen Box C/D-Enzymen im Vergleich zu archaealen Enzymen. Die hochauflösende Struktur der 2'-O-Methyltransferase Nop1 im Komplex mit Nop56 aus dem eukaryotischen Box C/D-Enzym zeigt signifikante Unterschiede zu den archaealen Orthologen. Die präsentierten Daten erweitern das strukturelle und funktionelle Wissen über eukaryotische Box C/D Enzyme und legen zusammen mit der vorhandenen Literatur erhebliche Unterschiede zwischen eukaryotischen und archaealen Box C/D-Enzymen da.
