The role of ClpC and its adaptor proteins in protein quality control systems of Bacillus subtilis

Abstract

Efficient protein quality control (PQC) systems are crucial in bacterial cells since they support adjustments of regulatory processes under changing environmental conditions and are involved in stress response mechanisms. Under heat stress conditions many proteins are prone to misfold and aggregate, these impaired protein species are targeted by chaperones for refolding or proteases for degradation. In Bacillus subtilis the Hsp100/AAA+ protein ClpC is part of the PQC network and can interact with ClpP to form a protease complex (ClpCP), whereby substrate selection is carried out by specialized adaptor proteins for ClpC. During this work it was demonstrated that in vitro, the complete disaggregation and effective refolding of a heat aggregated substrate by ClpC depends on the adaptor protein and arginine kinase McsB as well as the phosphatase YwlE. The McsB kinase and YwlE phosphatase activities were identified to be essential for the refolding process. Furthermore, presence of active YwlE and McsB did not promote the degradation of substrates by ClpCP but disaggregation and refolding were favored. It was observed that the properties of the ClpCP interaction loop enable refolding or degradation of substrates. In conclusion, a unique arginine phosphorylation and dephosphorylation based system for effective substrate disaggregation and refolding by B. subtilis ClpC was characterized. The soil-dwelling bacterium B. subtilis is an established model organism to study the regulation of biofilm formation and composition. The biofilm protein TasA forms amyloid-like fibrils and is essential for the matrix structure. NMR spectroscopic studies observed that in native biofilms predominantly homogenous TasA fibrils occur. The crystal structure of TasA revealed two polyproline II (PPII) helices in dynamic regions of the protein. Mutations in these helices demonstrated that these flexible segments are involved in TasA protein folding and export. Moreover, the influence of ClpC on regulation and structure of the biofilm was examined. An enhanced biofilm wrinkle formation was observed when no substrate degradation by ClpCP was possible. A similar phenotype was visible in an ypbH deletion strain, indicating that this adaptor protein might play a role in ClpCP dependent regulation of biofilm formation in B. subtilis.

In bakteriellen Zellen sind effiziente Proteinqualitätskontrollsysteme von zentraler Bedeutung, da sie die Anpassung regulatorischer Prozesse an wechselnde Umweltbedingungen unterstützen und an Stressantworten beteiligt sind. So können durch Hitzestress fehlgefaltete und aggregierte Proteine erkannt und durch Chaperone neu gefaltet oder durch Proteasen abgebaut werden. In B. subtilis ist das Hsp100/AAA+ Protein ClpC Teil des Proteinqualitätskontrollsystems und kann durch Kopplung mit ClpP einen Proteasekomplex (ClpCP) bilden, wobei die Substraterkennung und -auswahl von spezialisierten Adapterproteinen für ClpC vorgenommen wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in vitro die komplette Disaggregation und wirksame Rückfaltung von Hitze induzierten Proteinaggregaten durch ClpC von Adapterprotein und Proteinargininkinase McsB, sowie von der Phosphatase YwlE abhängt. Als wesentlich für den Rückfaltungsprozess wurden insbesondere die Kinaseaktivität von McsB und die Phosphataseaktivität von YwlE identifiziert. Zudem wurde in Gegenwart von aktivem YwlE und McsB nicht die Degradation von Substraten durch ClpCP, sondern die Disaggregation und Rückfaltung bevorzugt. Es konnte gezeigt werden, dass die Eigenschaften der ClpCP Interaktionsschleife dazu beitragen Rückfaltung oder Degradation von Substraten zu ermöglichen. Folglich wurde hier ein bisher einzigartiges auf Argininphosphorylierung und -dephosphorylierung basierendes System für effiziente Disaggregation und Rückfaltung durch B. subtilis ClpC charakterisiert. Das im Boden lebende Bakterium B. subtilis ist außerdem ein Modellorganismus für Studien der Regulation von Biofilmbildung und -komposition. Das Matrixprotein TasA bildet amyloid-ähnliche Fibrillen und ist essenziell für die Biofilmstruktur. Anhand von NMR-Spektroskopie Studien konnte gezeigt werden, dass im nativen Biofilm hauptsächlich homogene TasA Fibrillen vorkommen. Die Kristall-Struktur von TasA wies auf zwei Polyprolin II (PPII) Helices in dynamischen Regionen des Proteins hin. Mutationen in diesen PPII Helices zeigten, dass diese flexiblen Bereiche zu Faltung und Export von TasA beitragen. Außerdem wurde der Einfluss von ClpC auf die Regulation und Struktur des Biofilms untersucht. Eine erhöhte Faltenbildung der Matrix wurde immer beobachtet, wenn die Substratdegradation durch ClpCP beeinträchtigt war. Ein vergleichbarer Phänotyp im ypbH Deletionsstamm deutete auf eine Rolle dieses Adapterproteins in der ClpCP abhängigen Biofilmregulation hin.