The permeability barrier of the outer membrane in Gram-negative bacteria possess an inherent defense towards antibiotics and is subject of study using multidisciplinary approaches and cutting-edge techniques. In this study, a medium-high throughput assay based on liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was optimized and applied for comparing the degree of uptake of antibiotics with different modes of action into E. coli and P. aeruginosa. This method allowed the elucidation of time-course profiles of rapidly accumulated compounds and helped to differentiate accumulation profiles of nine antibiotics between the two Gram-negative species. The strain transferability of this assay allows the systematic assessment of the uptake of a broad range of compounds in different microorganisms. Apart from an increased impermeability, pathogenic bacteria quickly adapt metabolically to cope with a wide variety of environmental stresses, including antibiotic stress. Exposure to sub-lethal but constant concentrations of antibiotics in the environment plays an important role in enabling bacteria to make use of tolerance and resistance traits. In this study, the metabolic profile of wild type P. aeruginosa treated with different classes of antibiotics at sub-lethal concentrations showed important differences under a short exposure of two hours, and a long exposure of more than seven hours. P. aeruginosa maintained high levels of virulence-related metabolites, such as rhamnolipids, as a quick response to sudden antibiotic stress, indicating the readiness of bacteria to adapt quickly to environmental challenges.Fluoroquinolones, among the most potent antibiotics to date, are known to propitiate diverse bacterial responses, such as growth inhibition, biofilm production, and increased oxidative-stress response. However, these effects are associated to their potent activity and thought to be due to target interactions. In this study, two P. aeruginosa strains, one fluoroquinolone-susceptible with MIC of 0.15 µg/mL and one fluoroquinolone-resistant with MIC of 29.83 µg/mL, were subjected to an LC-MS/MS-based untargeted metabolomics analysis and provided with evidence of indirect responses to increasing concentrations of ciprofloxacin. In spite of the lack of an active target, the resistant mutant showed important off-target effects in response to ciprofloxacin accumulation. Those secondary-target effects were related to the virulence regulation of P. aeruginosa, such as the quorum sensing response, and to alterations in lipid metabolism and peptidoglycan assembly, and were correlated with ciprofloxacin accumulation.
Die äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien stellt eine inhärente Permeabilitätsbarriere gegen Antibiotika dar und ist daher Gegenstand von Untersuchungen mit multidisziplinären Ansätzen und modernsten Techniken. In dieser Studie wurde ein auf Flüssigkeitschromatographie-gekoppelter Tandem-Massenspektrometrie (LC MS/MS) basierender Assay mit mittlerem Durchsatz optimiert und eingesetzt, um die Aufnahme von Antibiotika mit unterschiedlichen Wirkmechanismen in E. coli und P. aeruginosa zu untersuchen. Die Methode ermöglichte, den Zeitverlauf der Aufnahme zu verfolgen und die Akkumulationsprofile von neun Antibiotika zwischen beiden Gram-negativen Spezies zu vergleichen. Der Assay erlaubt damit die systematische Bewertung der Aufnahme eines breiten Spektrums von Verbindungen in verschiedenen Mikroorganismen. Pathogene Bakterien passen ihren Metabolismus schnell an, um auf eine Vielzahl von Umweltbedingungen wie Antibiotikastress zu reagieren. Die Exposition von Bakterien mit subletalen, konstanten Konzentrationen von Antibiotika spielt eine wichtige Rolle bei der Ausbildung von Toleranz- und Resistenzeigenschaften. In dieser Studie zeigte das metabolische Profil eines Wildtypstamms von P. aeruginosa, der mit verschiedenen Klassen von Antibiotika in subletalen Konzentrationen behandelt wurde, wichtige Unterschiede zwischen einer kurzen Exposition von zwei Stunden und einer langen Exposition von mehr als sieben Stunden. Als schnelle Reaktion auf plötzlichen Antibiotika-Stress wurden hohe Konzentrationen virulenzbezogener Metabolite, wie z. B. Rhamnolipide, detektiert. Dies belegt die Fähigkeit der Bakterien, schnell auf sich verändernde äußere Umgebungen zu reagieren.Fluorchinolone, die eine hochwirksame Antibiotikaklasse darstellen, sind dafür bekannt, daß sie verschiedene bakterielle Reaktionen induzieren, wie z.B. verringertes Wachstum, Biofilmproduktion und eine erhöhte oxidative Stressreaktion. Es wird angenommen, dass diese Effekte eine Folge spezifischer Target-Interaktionen sind. In dieser Studie wurden zwei P. aeruginosa-Stämme, ein Fluorchinolon-sensitiver mit einer minimalen Hemmkonzentration (MHK) von 0,15 µg/mL und eine Fluorchinolon-resistenten Mutante mit einer MHK von 29,83 µg/mL, einer LC-MS/MS-basierten, ungerichteten Metabolomics-Analyse unterzogen. Trotz der fehlenden Target-Interaktion zeigte die resistente Mutante wichtige Off-Target-Effekte als Reaktion auf die Ciprofloxacin-Akkumulation. Diese Sekundär-Effekte standen im Zusammenhang mit der Virulenzregulation von P. aeruginosa, wie z. B. der Quorum-Sensing-Antwort. Weiterhin waren Veränderungen im Lipidstoffwechsel und der Peptidoglykan-Assemblierung mit der Ciprofloxacin-Akkumulation korreliert.