Detection of small molecules using aptamers

Abstract

Nucleic acid aptamers are versatile molecular recognition agents that bind to their targets with high affinity and selectivity. They can be selected by an in vitro procedure against a broad range of targets molecules including small molecules (molecular weight <1000 g/mol). Small molecules include toxins, antibiotics, molecular markers, drugs, and heavy metals ions. The detection of small molecules is important in different areas including public health, environmental monitoring, food safety, and antiterrorism. To meet the increasing demand for small molecule detection, methods are needed that are sensitive, reliable, rapid, cost effective and simple to use. In this context, aptamer-based detection platforms are becoming a promising alternative to conventional methods for small molecule detection. Concerning signal generation, mass-dependent detection methods, sandwich assay format and single-site binding assay formats are not always suitable for small molecule detection. The structural flexibility of aptamers enables the development of unique aptamer-based sensing platforms because aptamers fold into a well-defined three-dimensional structure upon binding to their target molecules. This specific property of aptamers allows to develop target-Induced dissociation (TID) of complementary oligonucleotide and target-induced structure switching (TISS)-based assays. In this PhD work, a novel aptamer-based assay (Apta-qPCR) was developed, which relies on TID for the detection of small molecules originating from biological, food and environmental samples. The Apta-qPCR assay was developed and optimized for the detection of ATP, ochratoxin A, and oxytetracycline. The assays are highly sensitive and selective for the target molecules. In addition, a rapid colorimetric assay was developed based on the TISS principle, which can detect ATP and ochratoxin A in 15 minutes.

Nukleinsäure-Aptamere sind vielseitige molekulare Biorezeptoren, die mit hoher Affinität und Selektivität an ihre Zielmoleküle binden. Durch ein In-vitro-Verfahren können sie gegen eine breite Palette von Zielmolekülen, einschließlich kleiner Moleküle (Molekulargewicht <1000 g/mol), selektiert werden. Zu den kleinen Molekülen gehören unter anderem Toxine, Antibiotika, molekulare Marker, Wirkstoffe und Schwermetallionen. Der Nachweis von kleinen Molekülen findet unter anderem in den Bereichen der öffentlichen Gesundheit, Umweltüberwachung, Lebensmittelsicherheit und Antiterrorismus Anwendung. Um der steigenden Nachfrage zum Nachweis verschiedener kleiner Moleküle gerecht zu werden, werden Methoden benötigt, die empfindlich, zuverlässig, schnell, kostengünstig und einfach zu bedienen sind. In diesem Zusammenhang entwickeln sich Aptamer-basierte Detektionsplattformen zu einer vielversprechenden Alternative zu herkömmlichen Methoden zur Detektion von kleinen Molekülen. Für den Nachweis von kleinen Molekülen sind massenabhängige Nachweisverfahren, Sandwich-Assays und Single-Site Binding-Assays nicht immer geeignet. Bei der Signalerzeugung ermöglicht die strukturelle Flexibilität der Aptamere die Entwicklung einzigartiger Aptamer-basierter Sensorplattformen, da die Nukleinsäure-Aptamere sich bei der Bindung an ihre Zielmoleküle in eine spezifische dreidimensionale Struktur falten. Diese besondere Eigenschaft von Aptameren ermöglicht die Entwicklung von Nachweisverfahren, die die Aptamer-spezifischen Mechanismen einer Target-induzierten Dissoziation von komplementären Oligonukleotiden (TID) und die Target-induzierte Strukturänderung (Target-Induced Structure Switch, TISS) nutzen. In dieser Doktorarbeit wurde ein neuartiger Assay, die Apta-qPCR, basierend auf dem TID Mechanismus für den Nachweis von kleinen Molekülen aus biologischen Proben, Lebensmittel- und Umweltproben, entwickelt. Der Apta-qPCR Assay wurde für den Nachweis von ATP, Ochratoxin A und Oxytetracyclin entwickelt und optimiert. Dabei konnte eine hohe Empfindlichkeit und Selektivität für die Zielmoleküle ermittelt werden. Außerdem konnte ein kolorimetrischer Schnelltest nach dem TISS-Prinzip entwickelt werden, der ATP und Ochratoxin A innerhalb von 15 Minuten nachweisen kann.