Funktionelle Analyse von TALEs in Xanthomonas oryzae und Entwicklung von TALENs zum Genome Editing

Abstract

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) sind pflanzenpathogene Bakterien, die in einigen Reisanbaugebieten zu schweren Ernteeinbußen führen. TALEs sind Virulenzfaktoren aus Xoo und fungieren als Transkriptionsaktivatoren in pflanzlichen Zellen. Mit Hilfe von bis zu 20 TALEs pro Stamm, verändert Xoo die pflanzliche Genexpression zu seinen Gunsten. Jedoch sind nur für wenige TALEs induzierte Zielgene bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier verschiedene Xoo-Stämme sequenziert und das TALE-Repertoire analysiert. Dabei wurden TALEs in Klassen eingeteilt und eine einheitliche Nomenklatur etabliert. Mit Hilfe einer RNA- seq-Analyse wurden neue potentielle Zielgene in Reis für 16 TALEs identifiziert. Dabei konnte das Gen Os03g03034, welches für eine Flavonol-Synthase kodiert, als potentielles Zielgen des TALEs TalAQ identifiziert werden. Durch die Induktion dieses Gens könnte Xoo pflanzliche Abwehrreaktionen unterdrücken. Um einer Infektion von Xoo entgegenzuwirken, ist es möglich die TALE-Bindestelle in Promotoren von Suszeptibilitätsgenen zu mutieren. Auf diese Weise können die TALEs nicht länger binden und rezessive Resistenzgene erstellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden TALE-Nukleasen (TALEN) erstellt, um die Bindestellen der natürlichen TALEs AvrXa7 und TalC zu mutieren. Somit konnte der Promotor eines der wichtigsten Suszeptibilitätsgene von Reis, OsSWEET14, durch unsere Kooperationspartner vom IRD und CIRAD in Montpellier, erfolgreich an zwei verschiedenen Stellen editiert werden. Drei der entstandenen Reislinien (sweet14-10, sweet14-11 und sweet14-32) wurden in dieser Arbeit, mit Hilfe von Inokulationsexperimenten, analysiert. Die durchgeführten Experimente weisen darauf hin, dass die Reislinien gegenüber Infektionen von Xoo-Stämmen mit den TALEs AvrXa7 bzw. TalC resistent sind. Somit konnten erfolgreich resistente Reispflanzen generiert werden. TALEN funktionieren als Paar, wobei zwei TALEN-Proteine in einer tail-to-tail-Orientierung an die DNA binden. So können die FokI-Monomere dimerisieren und die DNA spalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden, zur Vereinfachung dieser Technologie, single-chain TALEN (scTALEN) erstellt. Dafür wurden an einen TALE zwei heterodimerisierende FokI-Monomere fusioniert. Es konnte nachgewiesen werden, dass die scTALEN die DNA in vitro effizient spalten. Somit konnte eine neue Art benutzerdefinierbarer Restriktionsenzyme erstellt werden, welche es möglich machen, eine beliebige DNA-Sequenz an einer spezifischen Stelle mit einem definierten vier Basenpaar-Überhang zu spalten. Die Aktivität der scTALEN konnte in vitro, bisher jedoch nicht in vivo, detektiert werden. In Zukunft könnte diese Technik zum vereinfachten Genome Editing weiterentwickelt werden.