Entwicklung eines neuartigen, nicht invasiven insitu Kombi-Sensors (ISICOM) zur Überwachung des metabolischen Zustandes von Kultivierungsprozessen

Abstract

Laut der PAT-Guideline der Food and Drug Administration (FDA) in den USA aus 2004 ist eine kontinuierli-che real time Qualitätsanalyse notwendig. Durch das tiefere Verständnis soll aufgeklärt werden, wie in der Biotechnologie die Produktformulierung und der Herstellungsprozess zusammenhängen und wie die Pro-duktqualität beeinflusst wird (Food and Drug Administration 2004). Die meisten modernen biotechnologischen Prozesse verfügen dabei über das klassische Sensoren-Trio aus Temperatur, pH und Sauerstoff. Dieses Trio eignet sich für die Prozesssteuerung, erfüllt aber nicht die Anforderungen der Food and Drug Administration für Real-Time-Qualitätsanalyse bzw. den Anspruch, ein tieferes Prozessverständnis zur generieren. Da die Prozesse durch Zellen bestimmt werden, ist das Wissen, was in den Zellen vorgeht, wichtig und entscheidend für den Prozessverlauf. Der Metabolismus der Zellen ist in den meisten Fällen bekannt, zusammen mit den Ausnahmen bzw. den Bedingungen, unter denen die Zellen ihren Metabolismus umstellen. Was fehlt, ist eine Möglichkeit, die Änderung des Metabolismus in Echtzeit im Prozess beobachten zu können. So kann die Änderung des Metabolismus gekennzeichnet sein durch einen entkoppelten Anstieg der CO2-Konzentration in Zusammenhang mit einem geringen Sauer-stoffbedarf. Das oben genannte Sensor-Trio ist nicht dazu in der Lage, diese Informationen zur Verfügung zu stellen und damit bleiben die Informationen zum Metabolismus der Zellen im Prozess verborgen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Sensoren erweitern das klassische Sensor-Trio um einen in situ Kombi-sensor (ISICOM) bzw. eine Mikrofluidik-Sensorplattform (miniCOM), die die Möglichkeit bieten, die meta-bolische Aktivität der Zellen in Echtzeit im Prozess zu überwachen. Dabei werden Sensoren für den Ge-brauch in unterschiedlichen Reaktorskalen und Reaktortypen für den Multi- und Single-use- Bereich ent-wickelt. Die Sensoren messen dabei ein repräsentatives Volumenelement des Reaktorvolumens, mittels der dynamischen Methode. Durch diese Sensoren stehen Prozessgrößen wie Sauerstoffaufnahmerate (OUR), Kohlendioxidemissionsrate (CER), respiratorischer Quotient (RQ), Sauerstofftransportkoeffizient (kLa) und die zellspezifische Sauerstoffaufnahmerate (qOUR) in Echtzeit zur Verfügung. Sie bieten die Möglichkeit, bereits im frühen Stadium der Prozessentwicklung wertvolle Informationen zu sammeln und neuartige Prozessregelungsstrategien früh zu etablieren und dann im Laufe der Prozessentwicklung zu skalieren. Die weiterführende Charakterisierung von Vorarbeiten der Sensoren konnte zeigen, dass es keinen Rühr-mechanismus in der Messkammer des ISICOMs benötigt. Gleichzeitig konnte eine sterile Integration in des miniCOMs in unterschiedliche Reaktorsysteme gezeigt werden. Beim Einsatz der beiden Sensoren in biotechnologischen Prozessen mit Hefen und Tierzellen konnten Sau-erstoffaufnahmeraten über 50 mmol L-1 h-1 gemessen werden. Des Weiteren konnten Kohlenstoffdioxide-missionsraten bis 7 mmol L-1 h-1 gemessen werden. Zusätzlich konnte die zellspezifische Sauerstoffauf-nahme punktuell zur Erweiterung des Prozesswissens genutzt werden, sowie der Sauerstofftransportkoef-fizient kLa Online über den gesamten Prozess zur Verfügung gestellt werden. Die Kombination der Senso-ren des miniCOMs und des ISICOMs bilden eine vielversprechende Grundlage für die Entwicklung und Skalierung neuer Regelungsstrategien in der Prozessentwicklung und -charakterisierung.

According to the PAT guideline of the food and Drug Administration (FDA) in the USA from 2004, a con-tinuous real time quality analysis is necessary. The deeper understanding should clarify how the product formulation in biotechnology and the manufacturing process are interrelated and how the product quality is influenced (Food and Drug Administration 2004). Most modern biotechnological processes have the classic sensor trio of temperature, pH and oxygen. This trio is suitable for process control but does not meet the requirements of the Food and Drug Administra-tion for real time quality analysis or the need to generate a deeper understanding of the process. Since the processes are determined by cells, the knowledge of what is going on in the cells is important and crucial for the process. The metabolism of the cells is known in most cases, together with the exceptions or the conditions under which the cells switch their metabolism. What is missing is a way to observe the change in metabolism in real time in the process. For example, the change in metabolism may be charac-terized by a decoupled increase in CO2 concentration associated with a low oxygen demand. The sensor trio mentioned above is not able to provide this information and thus the information about the metabo-lism of the cells in the process remains bent. The sensors presented in this work expand the classical sensor trio by an insitu combi sensor (ISICOM) and a microfluidic sensor platform (miniCOM), which offer the possibility to monitor the metabolic activi-ty of the cells in real time in the process. Sensors are being developed for use in different reactor scales and reactor types for multi- and single-use applications. The sensors measure representative volume ele-ments of the reactor volume, using the dynamic method. These sensors provide real-time process varia-bles such as oxygen uptake rate (OUR), carbon dioxide emission rate (CER), respiratory quotient (RQ), oxygen transport coefficient (kLa) and cell-specific oxygen uptake rate (qOUR). They provide the oppor-tunity to collect valuable information in an early process development stage and to establish new process control strategies early and then scale up as the process development progresses. Further characterization of preliminary work on the sensors was able to show that no stirring mechanism is required in the measuring chamber of the ISICOM. At the same time, sterile integration of the miniCOM into different reactor systems could be demonstrated. When using the two sensors in biotechnological processes with yeasts and animal cells, oxygen uptake rates above 50 mmol L-1 h-1 could be measured. Furthermore, carbon dioxide emission rates up to 6 mmol L-1 h-1 could be measured. In addition, the cell-specific oxygen uptake could be used selectively to expand process knowledge, and the oxygen transport coefficient kLa could be made available online over the entire process. The combination of the sensors of the miniCOMs and the ISICOMs form a prom-ising basis for the development and scaling of new control strategies in process development and charac-terization.