Creation of Hypoallergenic Mustard (Brassica juncea) through Genome Editing and Development of Precise Base Editing Tools for Plants

Abstract

Eine verbesserte landwirtschaftliche Sicherheit durch neue Züchtungsverfahren ist dringend erforderlich, um den Zugang zu nahrhaften Lebensmitteln weltweit zu verbessern. Das Genom-Engineering mit Hilfe von CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Technologien oder TALE (transcription activator-like effector)-Technologien bietet die einzigartige Möglichkeit, gezielt Gene für eine präzise Züchtung zu verändern. Diese Technologie ist vielversprechend für verschiedene Anwendungen in der Allergieforschung. Das Hauptallergen Bra j I aus braunem Senf (Brassica juncea) ist ein Saatgut-Speicherprotein, das zur 2S-Albuminfamilie gehört. Ein Ziel dieser Arbeit war die Schaffung einer hypoallergenen Senfsorte durch den Einsatz von Genome Editing-Techniken und ein zweites Ziel war die Entwicklung neuer Baseneditoren für Pflanzen. Zunächst wurden zwei CRISPR/Cas9-Konstrukte mit Multiplex-Single-Guide-RNAs eingesetzt, um große Deletionen oder Frameshift-Mutationen in den beiden Homöologen Bra j IA und Bra j IB in zwei Linien des braunen Senf (Terratop und CR2664) zu induzieren. In den transgenen T0-Senfpflanzen wurden hohe Mutationseffizienzen beobachtet. Das Bra j IB-Allel wies in vier Linien große Deletionen zwischen 566 und 790 bp auf. Außerdem wiesen neun von 18 Terratop-T0-Linien kleine Indels in den Zielregionen auf. In ähnlicher Weise wiesen 14 der 16 analysierten CR2664 T0-Linien Indels auf, während drei Linien Mutationen in allen vier Bra j I-Allelen aufwiesen. Die Mutationen wurden stabil an die T1-Nachkommen vererbt. Darüber hinaus zeigten Immunoblotting-Ergebnisse eine Abnahme oder ein vollständiges Fehlen des Bra j I-Proteins in den Samenextrakten ausgewählter T1-Linien. Diese Arbeit unterstreicht den Wert von Genom Editing Technologien für die Schaffung hypoallergener Lebensmittelpflanzen. Zweitens wurden zwei Baseneditoren entwickelt: TALE-abgeleitete DddA-basierte Cytosin-Baseneditoren (TALE-DdCBEs) und TALE-abgeleitete Adenin-Baseneditoren (TALE-ABEs). Sie wurden entwickelt, um eine präzise Bearbeitung von C•G-to-T•A bzw. A•T-to-G•C zu erstellen. TALE-DdCBEs, die DddA-Varianten (DddA6 oder DddA11) enthielten, zeigten eine deutliche Verbesserung der Editierungseffizienz sowohl in Nicotiana benthamiana als auch in Reisprotoplasten. TALE-DdCBEs mit DddA11 wiesen eine bessere Sequenzkompatibilität für die Bearbeitung von Nicht-TC-Zielen auf. Darüber hinaus wurden verschiedene TALE-ABEs mit unterschiedlichen Desaminase-Fusionsarchitekturen in Reis und N. benthamiana getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass TALE-ABEs A•T-to-G•C Umwandlungen im Reisprotoplasten ermöglichen. TALE-Base-Editoren können für nukleare Gene eingesetzt werden oder alternativ über N-terminale Targeting-Sequenzen die Genome von Plastiden oder Mitochondrien zum Ziel haben.

Improved agricultural safety through novel breeding techniques is urgently required to increase access to nutritious foods worldwide. Genome engineering using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-based or transcription activator-like effector (TALE)-based technologies provides a unique ability to modify targeted genes for precise breeding. This technology shows promise in various applications of allergy research. The major allergen Bra j I from brown mustard (Brassica juncea) is a seed storage protein that belongs to the 2S albumin family. One aim of this thesis was to create a hypoallergenic variety of mustard by utilizing genome editing techniques and a second aim was to develop novel base editing tools for plants. Firstly, two CRISPR/Cas9 constructs with multiplex single guide RNAs were employed to induce large deletions or frameshift mutations in both Bra j IA and Bra j IB homoeologs in two brown mustard lines (Terratop and CR2664). High mutation efficiencies were observed in the T0 transgenic mustard plants. The Bra j IB allele exhibited large deletions ranging from 566 to 790 bp in four lines. Additionally, nine out of 18 Terratop T0 lines exhibited small indels in the targeted regions. Similarly, 14 out of 16 CR2664 T0 lines analyzed had indels, while three lines exhibited mutations in all four Bra j I alleles. The mutations were stably inherited to the T1 progeny. Moreover, immunoblotting results demonstrated a decrease or complete absence of the Bra j I protein in the seed extracts of selected T1 lines. This work highlights the value of genome editing technologies in creating hypoallergenic food plants. Secondly, two base editing tools: TALE-derived DddA-based cytosine base editors (TALEDdCBEs) and TALE-derived adenine base editors (TALE-ABEs) were developed for precise C•G-to-T•A and A•T-to-G•C editing, respectively. TALE-DdCBEs containing evolved DddA variants (DddA6 or DddA11) showed a significant improvement in editing efficiency in Nicotiana benthamiana and rice protoplasts. TALE-DdCBEs containing DddA11 exhibited broader sequence compatibility for editing non-TC targets. Furthermore, a series of TALE-ABEs with different deaminase fusion architectures were tested in N. benthamiana and rice. The results showed that TALE-ABEs enable the conversion of A•T-to-G•C in rice protoplast. The application of TALE-base editors can result in a dramatic change because they can be deployed for nuclear genes or, alternatively, target the genomes of plastids or mitochondria by N-terminal targeting sequences.