Bartling, Bastian: Analytische Verfahren bei der biotechnologischen Produktion niedermolekularer Polysialinsäure. Hannover : Gottfried Wilhelm Leibniz Universität, Diss., 2021, XIII, 98 S. DOI: https://doi.org/10.15488/10510
Abstract: | |
Polysialinsäure (polySia) ist ein lineares Homopolymer aus α2,8- oder α2,9-verknüpften Monomeren der negativ geladenen N-Acetylneuraminsäure, das meist auf der äußeren Zellmembran bestimmter humanpathogener Bakterien wie Escherichia coli (E. coli) K1 vorkommt. Darüber hinaus existiert die α2,8-verknüpfte Form auch im zentralen Nervensystem des Menschen. Das Polymer ist aufgrund seiner biologischen Eigenschaften und Funktionen ein vielversprechendes Molekül zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD). Als potenzielles Arzneimittel unterliegen die Herstellung und Produktqualität den behördlichen Vorgaben des Good Manufacturing Practice (GMP). Daher wird polySia für gewöhnlich durch Kultivierung von E. coli K1 in vorsterilisierten Einweg-Beutelreaktoren produziert. Anschließend wird das Polymer unter Verwendung verschiedener Einweg-Prozesselemente wie Filtern und Membranadsorber in hochreiner Form aus dem Kulturüberstand gewonnen.In dieser Arbeit wurde zunächst die konventionelle polySia-Produktion in E. coli K1 mit einem rekombinanten Ansatz in nicht-pathogenen E. coli BL21-Produktionsstämmen verglichen. Im Kulturüberstand des Wildtyps waren polySia-Konzentrationen von bis zu 774 (±18) mg/L nachweisbar. In rekombinanten Produktionsstämmen konnten dagegen nur maximal 133 mg/L erreicht werden. Im Anschluss wurden prozessbedingte Verunreinigungen wie zelleigene Proteine (HCPs), DNA und Endotoxine über einen etablierten Reinigungsprozess entfernt, so dass 4,5 (± 0,5) g reine polySia aus einer 25 L E. coli K1-Kultur gewonnen wurden. Dies entspricht einer Ausbeute von 29 (±5) %. Die Ausbeuten aus den Kulturüberständen der rekombinanten Produktionsstämme lagen mit 8 % - 15 % deutlich niedriger. Die hohen Endotoxinkonzentrationen im Kulturüberstand können während der Reinigung durch eine alkalische Lyse auf < 5 EU/mgpolySia reduziert werden. Um polySia produktschonender zu reinigen, wurde u. a. die hydrophobe Interaktionschromatographie zur Entfernung von HCPs und Endotoxinen getestet. Die Analyse des Endproduktes mittels HPLC-Analytik und NMR-Spektroskopie bewies, dass keine der verwendeten Methoden das Produkt schädigte. Aus der reinen polySia (Polymerisationsgrad: DP > 90) konnte anschließend pharmazeutisch relevante polySia (DP 21 ± 4) über Thermolyse gewonnen werden. | |
License of this version: | CC BY 3.0 DE |
Document Type: | DoctoralThesis |
Publishing status: | publishedVersion |
Issue Date: | 2021 |
Appears in Collections: | Naturwissenschaftliche Fakultät Dissertationen |
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