Entwicklung einer lichtinduzierten Proteinsynthese in optogenetisch aktivierbaren Säugerzellen für therapeutische Applikationen

Abstract

In der Optogenetik, einer Kombination aus Optik und Genetik, werden Zellen durch genetische Manipulation lichtempfindlich, sodass Zellfunktionen gezielt durch Licht gesteuert, Krankheiten analysiert und neue Ansätze für Heilmethoden entwickelt werden können. Ein optogenetisches System besteht meist aus zwei Transkriptionsfaktoren, die unter Lichtaktivierung eines Chromophors eine Einheit bilden, der den Promotor der Zielsequenz aktiviert und die Proteinsynthese startet. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer lichtinduzierten Proteinsynthese in optogenetisch aktivierbaren humanen Zellen für therapeutische Applikationen. Es könnten z. B. patienteneigene mesenchymale Stammzellen (hMSCs) während der Implantation auf dem CI (Cochleaimplantat) platziert werden, die auf Lichtinduktion hin BDNF (brain-derived neurotropic factor) synthetisieren. BDNF hat einen positiven Effekt auf Spiralganglionzellen, die wiederrum die auditorische Vermittlung von CIs verbessern. Durch die gute zeitliche und räumliche Auflösung optogenetischer Systeme wird umliegendes Gewebe geschont und ungewollte Nebeneffekte minimiert. Als Modellzellen wurden Säugertierzellen verwendet. Eine Etablierung des optogenetischen PhyB (phytochrome B)-Systems in CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary) Zellen mit EGFP (green fluorescent protein) Marker führte nach Optimierung zu einer 5-mal höheren Proteinexpression im Vergleich zur Leakage, während beim CRY2 (Cryptochrome 2)-System in HEK293 (human embryonic kidney) Zellen mit Luciferase (Luc) Marker eine um den Faktor 26 gesteigerte Proteinexpression erzielt wurde. Eine Analyse der Genexpression mittels qPCR (quantitative Polymerase-kettenreaktion) bestätigte diese Ergebnisse. Beide Systeme konnten sowohl mittels LED-Induktion (light emitting diode) wie auch durch Laser-Induktion aktiviert werden und das Protein BDNF optogenetisch synthetisiert werden, wobei nur das CRY2-System eine therapeutisch relevante Konzentration erzeugte. Für eine Übertragung dieser Systeme auf hMSCs, hier aus Fettgewebe isoliert, wurden diverse Transfektionsmethoden getestet. Eine chemische Transfektion (mit DreamFect™ Gold) lieferte mit einer Einzel-Transfektionseffizienz von ca. 35 % zwar die besten Ergebnisse, lag aber mit einer Ko-Transfektionseffizienz lediglich bei 6 %. Somit ist sie in dieser Form noch nicht für therapeutische Anwendungen nutzbar.

In optogenetics, a combination of optics and genetics, cells become light-sensitive through genetic manipulation, so cell functions can be specifically controlled by light, diseases can be analyzed and new approaches for cures can be developed. An optogenetic system consists usually of two transcription factors that assemble into a unit under light activation of a chromophore, which activates the promoter of the target sequence and starts protein synthesis. The aim of the present work was the development of a light-induced protein synthesis in optogenetically activatable human cells for therapeutic applications. For example patient-derived mesenchymal stem cells (hMSCs) could be placed on the CI (cochlear implant) during implantation and synthesize BDNF (brain-derived neurotropic factor) upon light induction. BDNF has a positive effect on spiral ganglion cells which in turn enhance auditory mediation of CIs. The good temporal and spatial resolution of optogenetic systems spares surrounding tissue and minimizes unwanted side effects. Mammalian cells were used as model cells. Establishment of the optogenetic PhyB (phytochrome B) system in CHO-K1 (Chinese hamster ovary) cells with EGFP (green fluorescent protein) marker resulted in 5-fold higher protein expression after optimization compared to leakage while a 26-fold increase in protein expression, was obtained for the CRY2 (cryptochrome 2)-system in HEK293 (human embryonic kidney) cells with luciferase marker. Analysis of gene expression by qPCR (quantitative polymerase chain reaction) confirmed these results. Both systems could be activated by LED (light emitting diode) induction as well as by laser induction and synthesized the protein BDNF optogenetically whereas only the CRY2-system produced a therapeutically relevant concentration. Various transfection methods were tested to transfer these systems into hMSCs here isolated from adipose tissue. Chemical transfection (using DreamFect™ Gold) provided the best results with a single transfection efficiency of about 35%, but co-transfection resulted in a transfection efficiency of only 6%. Thus it is not yet applicable for therapeutic applications in this form.